人乳腺癌相关成纤维细胞的原代培养及其生物学特性

目的原代培养人乳腺癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF),并检测其生物学特性。方法采用胶原酶消化培养法对26份乳腺癌患者标本进行原代细胞分离培养,倒置显微镜下观察人乳腺癌CAF的形态学特性,免疫荧光染色法鉴定所分离培养的人乳腺癌CAF纤维连结蛋白(Fibronectin,FN)和成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activated protein,FAP)的表达,并通过MTT法和细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果胶原酶消化法的最适酶浓度为0.12%,最适消化时间为10 h。原代培养23份成功,3份失败。培养成功的细胞贴壁生长,形态完整,生长状态良好,背景清晰,有明显的对数生长期,并可传代培养。培养的细胞FN和FAP表达阳性,表明原代培养的CAF为乳腺癌CAF。结论胶原酶消化培养法适合人乳腺癌CAF的原代培养,通过该方法可建立理想的人乳腺癌CAF体外实验模型。     

蒺藜皂苷对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用

目的:通过建立H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤模型,观察GSTT对心肌细胞的保护作用.方法:本实验通过对大鼠乳鼠心肌细胞进行体外培养,采用H2O2制备心肌细胞氧化应激损伤模型,MTT法检测细胞存活率,荧光显微镜观察Hoechst33258染色凋亡心肌细胞形态,流式细胞术检测凋亡率及NF-kB含量.结果:蒺藜皂苷明显保护...     

还原氧化石墨烯对人原代成纤维细胞的毒性研究

通过氧化石墨烯制备还原氧化石墨烯,采用透射电子显微镜对其进行表征,并将其作用于人原代成纤维细胞,通过CCK8法细胞活性检测和细胞划痕实验研究还原氧化石墨烯对人原代成纤维细胞的毒性。结果表明:与氧化石墨烯相比,还原氧化石墨烯颜色变深,粉末变细,具有明显的薄层和褶皱结构;CCK8法细胞活性检测结果显示5μg·mL~(-1)是还原氧化石墨烯对人原代成纤维细胞的安全浓度;细胞划痕实验结果显示还原氧化石墨烯浓度小于5μg·mL~(-1)时对人原代成纤维细胞的愈合没有影响。     

大鼠脂肪干细胞两种培养方法的比较

目的采用组织块培养法和胶原酶消化法体外培养大鼠脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),并对两种培养方法进行比较分析。方法分离SD大鼠腹股沟处脂肪组织,分别采用组织块培养法和胶原酶消化法获取ADSCs,并对其进行原代培养和传代培养,观察细胞形态,比较细胞的产量和增殖能力;分别用化学成脂诱导剂和化学成骨诱导剂诱导ADSCs分化,观察其分化情况,并计算成脂量。结果组织块培养法和胶原酶消化法培养ADSCs的成功率分别为79%和53%,获得的第4代ADSCs多为成纤维细胞样,长梭形或纺锤形,无形态学差异,传至第8代,细胞生长状态良好,传代后细胞性状均一,生物学特性稳定;培养第7天,组织块培养法每毫克脂肪组织获得的细胞产量高于胶原酶消化法,差异有统计学意义(P0.05);第4代ADSCs生长曲线均为相似的"S"型,细胞倍增时间分别为96.56和95.84 h;ADSCs均可向脂肪细胞和骨细胞方向分化,培养第7天,两组间成脂量差异无统计学意义(P0.05)。结论脂肪组织块培养法是更适合的体外获取ADSCs的方法。     

西洋参皂苷对缺血-再灌注诱导乳鼠心肌细胞凋亡及钙浓度的影响

目的探讨西洋参皂苷(Panax quinquefolius saponin,PQS)对缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导乳鼠心肌细胞凋亡及钙浓度的影响。方法将原代培养的心肌细胞分为正常对照组(不做任何处理)、I/R组(心肌细胞经缺氧、无血清孵育2 h,再复氧、复血清培养24、48 h,以模拟心肌I/R损伤)和西洋参总皂苷干预组(PQS+I/R,细胞再灌注时分别加入5、10、20、40μg/ml PQS),采用台盼蓝染色法检测各组心肌细胞的活性;流式细胞术检测心肌细胞的凋亡率;激光扫描共聚焦显微镜检测心肌细胞内游离钙的变化。结果与I/R组比较,10、20、40μg/ml PQS+I/R组心肌细胞活性显著增加(P0.01),心肌细胞凋亡率显著降低(P0.05);20μg/ml的PQS可降低心肌细胞的钙负载。结论 PQS可显著减少I/R诱导的心肌细胞凋亡,并减轻心肌细胞钙超载的发生,这可能是PQS抑制I/R心肌细胞凋亡的机制之一。     

肝癌细胞上清液对成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白、环氧合酶-2和肝细胞生长因子的影响

目的观察小鼠肝癌细胞上清液对成纤维细胞增殖及表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的影响。方法制备小鼠成纤维细胞,并分别用普通培养液、小鼠肝癌细胞上清液的条件培养液及含转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的培养液培养成纤维细胞。采用MTT法检测3种培养液培养的成纤维细胞的增殖活力;RT-PCR和免疫组织化学法检测3种培养液培养的成纤维细胞中α-SMA、COX-2、HGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达情况。结果条件培养液及含TGF-β1的培养液对成纤维细胞的增殖均有促进作用,但条件培养液的促进作用更强。普通培养液培养的成纤维细胞在第5天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞在第3天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,且明显高于普通培养液在第5天时的转录水平,第3天以后转录水平稳定;普通培养液培养的成纤维细胞中无COX-2和HGF转录;条件培养液及含TGF-β1的培养液培养的成纤维细胞在第5天时COX-2和HGF基因mRNA的转录水平最高,第5天后无明显下降。不同培养液培养的成纤维细胞中α-SMA蛋白在胞浆、胞膜均有不同程度的表达;普通培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白不表达,而含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白为阳性表达,表达部位均为胞浆。结论小鼠肝癌细胞上清液能有效、稳定地将成纤维细胞激活为稳定表达COX-2和HGF的肌成纤维细胞,其有望成为在细胞移植中促进移植细胞存活及血管重建的细胞。     

BrdU标记家兔成纤维细胞的体外及体内实验观察

目的用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记家兔皮肤成纤维细胞,确定最佳标记方法,探讨其作为成纤维细胞示踪方法的可行性。方法取12～16周龄健康中国大耳白兔颈部皮肤,胶原酶消化,分离并培养成纤维细胞。取第3代细胞,加入终浓度分别为2.5、5、10和15μg/ml的BrdU共培养,MTT法检测细胞的生长情况。分别用2.5、5、10和15μg/ml的BrdU标记第3代细胞,标记6、12、24和48h后,采用免疫荧光法检测各组细胞的标记阳性率。以最佳剂量及时间标记家兔成纤维细胞,与壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶混合后,注入兔颈内动脉,1周后,免疫荧光法观察植入细胞。结果加入BrdU48h内,各浓度的BrdU对家兔成纤维细胞生长的影响均不明显。标记剂量及标记时间均可影响标记率,但标记时间的影响更大。5μg/ml剂量标记24h,标记率可达(94.50±2.08)%,再加大标记剂量或延长标记时间,标记率提高不明显。以该方法标记的家兔成纤维细胞注入家兔颈内动脉1周后,可在兔颈内动脉观察到大量标记细胞。结论BrdU对家兔成纤维细胞的最佳标记方法为5μg/ml标记24h,该方法对细胞影响小,标记率高,适用于成纤维细胞体内示踪。     

传染性法氏囊病病毒增殖的研究

传染性法氏囊病（ＩＢＤ）是一种对养鸡业造成极大危害的鸡瘟病．传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ：疫苗的生产目前仍是通过鸡胚或鸡胚成纤维细胞等原代细胞转瓶培养获得．本文利用细胞培养ＩＢＤＶ生产疫苗，目的是降低成本，提高产量．　ＩＢＤＶ原代鸡胚成纤维细胞（ＰＣＥＦ）最佳增殖条件为１：１００接毒量，接毒时的细胞密度为２．７ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，培养液的血清浓度为２％，加入一定量的ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８和ＡｎｔｉｆｏｒｍＣ，初始ｐＨ值６．８，３７℃培养．可用次代鸡胚成纤维细胞（ＳＣＥＦ）代替ＰＣＥＦ进行…     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞的分化

目的探讨乳鼠视网膜细胞条件分化液诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)的神经分化情况,以期为视网膜退行性疾病提供治疗方案。方法体外分离培养Wistar大鼠乳鼠BMSCs,观察BMSCs的增殖情况并进行鉴定;制备乳鼠视网膜细胞条件分化液,以其诱导BMSCs,观察BMSCs的神经分化情况,并行免疫组化鉴定。结果体外培养获得了较纯的BMSCs;在乳鼠视网膜细胞条件分化液的环境中,诱导后72h,BMSCs胞体收缩成锥形或球形,细胞突起变细、变长,呈神经细胞的典型形态;免疫组化结果显示,部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)和Thy1.1阳性反应。结论乳鼠视网膜细胞条件分化液可诱导BMSCs分化成视网膜神经节样细胞。     

沪191麻疹病毒疫苗株连续传代的基因稳定性

目的研究沪191麻疹病毒疫苗株(S191)在原代鸡胚成纤维细胞中连续传代的基因稳定性,为评估和控制麻疹疫苗的免疫原性及安全性提供依据。方法取S191的22代冻干主种子批在SPF原代鸡胚成纤维细胞上连续传代获得的23、26(用于生产的疫苗代次)、29、31和33代病毒液,提取病毒RNA,RT-PCR扩增后,进行全序列测定,并对病毒关键的保护性抗原进行核苷酸和氨基酸序列分析。结果与22代全基因比较,核苷酸序列同源性:26代为99.96%,33代为99.92%;氨基酸序列同源性:26代为99.98%,33代为99.89%。26代疫苗病毒仅M蛋白第123位氨基酸由苏氨酸→赖氨酸,33代病毒有5个氨基酸差异。结论 26代S191麻疹疫苗疫苗病毒的基因结构高度稳定,疫苗可保持主种子病毒的免疫原性和安全性。     

激活素A对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用

目的研究激活素A(Activin A)对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用。方法原代培养孕期17d小鼠胎鼠脑神经细胞,免疫细胞化学染色观察激活素受体(ActRIIA)在神经细胞中的表达;将原代培养神经细胞分为阴性对照组(5%胎牛血清-DMEM/F12培养基)、阳性对照组(4ng/ml神经生长因子)和激活素A(5ng/ml)组,分别于培养第1、3、5、7和9天,采用台酚蓝染色法检测神经元存活情况。结果培养的小鼠胎鼠脑神经细胞可表达ActRIIA;阴性对照组存活神经元呈时间依赖性减少,在培养第9天已检测不到存活的神经元;而阳性对照组和激活素A组在培养第9天仍有部分神经元存活。结论激活素A具有维持小鼠胎鼠大脑皮层神经元长期存活的作用。     

维持静息细胞周期状态的小鼠肝细胞的分离纯化和原代培养

目的建立维持正常肝细胞静息细胞周期状态的小鼠肝细胞的分离纯化及原代培养方法。方法对传统小鼠肝细胞分离纯化的原位两步胶原酶灌流法进行改良,台盼蓝染色法计数细胞总数并鉴定肝细胞活率;用改良的WME培养基对C57BL/6小鼠肝细胞进行原代培养,经过碘酸雪夫氏染色(Periodic acid-Schiff stain,PAS)和全自动生化分析仪鉴定肝细胞的生物学特性及功能;Western blot法检测分离纯化后的小鼠肝细胞及原代培养24、48、72、96 h小鼠肝细胞的细胞周期蛋白p16、cyclin D1和cyclin A的表达水平。结果分离纯化后可从每只小鼠肝脏稳定获取(3～5)×107个肝细胞,细胞活率达(86.68±2.46)%;原代培养96 h内的小鼠肝细胞能保持合成糖原、白蛋白、尿素的功能;原代培养小鼠肝细胞中,细胞周期蛋白p16、cyclin D1和cyclin A的表达水平与分离纯化的小鼠肝细胞相比,差异无统计学意义(P>0.05),表明原代培养96 h内的小鼠肝细胞均能维持静息细胞周期状态。结论改良的分离纯化方法能稳定获得高产量、高活率的小鼠肝细胞;改良后的原代培养方法可使肝细胞维持其特异性功能、分化特性及静息细胞周期状态。     

重组猪胰蛋白酶在制备狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)中的应用

目的探索重组猪胰蛋白酶(简称重组猪胰酶)在制备狂犬病疫苗[鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)]中的应用。方法采用SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定重组猪胰酶及猪胰酶;用1.25 mg/mL猪胰酶及1、0.25、0.0625、0.015625 mg/mL重组猪胰酶分别消化制备原代CEF,比较细胞活率、单胚细胞收获量、体外培养48 h的细胞增殖比及培养96 h的细胞形态,筛选最适重组猪胰酶工作浓度;用最适浓度重组猪胰酶及1.25 mg/mL猪胰酶消化后原代CEF对狂犬病病毒滴度的影响。结果重组猪胰酶仅有1条蛋白条带,纯度100%,而猪胰酶有多条蛋白杂带,纯度33%;与1.25 mg/mL猪胰酶比较,0.0625 mg/m L重组猪胰酶消化的CEF细胞活率、单胚细胞收获量及培养48 h的细胞增殖比差异均无统计学意义(P均>0.05),且其细胞形态相当,其最适工作浓度为0.0625 mg/mL;2种胰酶制备CEF的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组猪胰酶可代替猪胰酶用于狂犬病疫苗(CEF细胞)的生产。     

驴乳延缓皮肤衰老的研究

使用驴乳溶液处理正常人原代真皮成纤维细胞(HDFn细胞)和人永生化表皮细胞(HaCaT细胞),检测了驴乳对细胞活性、细胞增殖、损伤修复的影响。研究了驴乳溶液处理HDFn细胞后细胞外基质(胶原蛋白、基质金属蛋白酶)含量的影响。质量浓度为0.63～10mg/m L驴乳作用于HDFn细胞和HaCaT细胞,细胞安全无毒性。通过Brd U法检测不同质量浓度的驴乳对HDFn细胞和Ha CaT细胞的增殖能力,5、10mg/m L驴乳具有显著的促进细胞增殖的作用(p0.01)。与阴性对照相比,5、10mg/m L驴乳可促进HDFn细胞中ColⅠ合成(p0.01),抑制MMP-1分泌。5、10mg/m L驴乳作用HDFn细胞24 h后,与阴性对照相比,细胞愈合率显著提高(p0.01)。驴乳可促进细胞增殖、增加胶原蛋白含量、抑制MMP-1分泌、促进损伤修复,发挥延缓皮肤衰老的作用,为其在护肤品中的应用提供科学依据。     

氟对二维和三维培养的成纤维细胞胰岛素样生长因子-1表达的影响

目的观察不同浓度氟化物在不同时间段对二维(2D)和三维(3D)培养的成纤维细胞胰岛素样生成因子-1(IGF-1)表达的影响,并探讨其在氟化物刺激成纤维细胞成骨功能方面的作用。方法在2D和3D培养系统中,将成纤维细胞L929分为对照组(F-浓度为0mg/L)和6个染氟组(F-浓度分别为0.0001、0.001、0.1、1、10和20mg/L),在不同染氟时间段(2D培养2、4、24、48和72h,3D培养4、24、48、72和96h),采用ELISA法检测细胞培养上清中IGF-1蛋白的含量;免疫组化法(IHC)检测染氟成纤维细胞中IGF-1的表达;RT-PCR法检测染氟成纤维细胞IGF-1基因mRNA的转录水平。结果染氟可明显刺激成纤维细胞培养上清中IGF-1蛋白的表达;各染氟组成纤维细胞胞浆IGF-1的阳性着色较对照组均明显增强;氟作用48h,除F-浓度为20mg/L组外,其余各染氟组成纤维细胞IGF-1基因mRNA的转录水平较对照组均有不同程度的增强,但差异均无统计学意义。结论在2D和3D两种培养条件下,氟化物均可明显刺激成纤维细胞IGF-1的表达,提示在氟化物诱导成纤维细胞成骨功能增强的过程中,IGF-1可能发挥着重要作用。     

不同温度培养的3株EV71毒株的增殖动力学分析

目的对不同温度培养的3株EV71中国流行株的增殖动力学进行分析。方法分别在32、35、37和40℃条件下对FY23、K9和S1株EV71进行传代培养、2～24h培养及噬斑培养,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;传代培养的子代病毒通过脑内注射方式感染新生ICR乳鼠,观察病毒的致病性。结果传代培养时,在32和40℃培养的3株病毒致细胞完全病变时间较35和37℃延长,且子代病毒滴度下降,35℃培养的病毒滴度较37℃升高;3株病毒培养24h后,37℃培养的病毒增殖效率最高,35℃次之,40℃最低;4个温度培养的病毒噬斑形态无明显变化;新生乳鼠脑内注射致死率差异无统计学意义(P>0.05)。结论培养温度的变化可影响EV71的致细胞病变速度及子代病毒的增殖,但对病毒噬斑的形态及新生乳鼠的致病能力无明显影响。     

经皮植入体对大鼠皮肤成纤维细胞的作用研究

对自行研制的新型经皮通路植入材料致密增强羟基磷灰石基陶瓷、医用硅橡胶/羟基磷灰石复合材料进行体外细胞毒性评价.原代培养大鼠皮肤成纤维细胞,并与材料的浸提液相互作用,用MTT法测定新型经皮通路材料的细胞毒性.结果表明,致密增强羟基磷灰石基陶瓷、医用硅橡胶/羟基磷灰石复合材料均无细胞毒性.     

小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体的分离及鉴定

目的 分离纯化小鼠原代腹腔巨噬细胞分泌的外泌体并进行鉴定。方法 分别经5只雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤,灌洗获得小鼠原代腹腔巨噬细胞后,用流式细胞术分析纯度。采用ExoQuick TC外泌体试剂盒提取小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体,BCA试剂盒测定外泌体蛋白含量,透射电镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径及分布,Western blot法检测外泌体标志物(CD9、CD63和TSG101)的表达。结果 每只小鼠可获得约5×10⁶个纯度为(99.17±0.65)%的腹腔巨噬细胞。5 mL小鼠原代腹腔巨噬细胞培养上清液中可提取869μg外泌体蛋白。小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体在电镜下呈折光性较强的典型茶托样囊泡,高表达外泌体特异性标志物TSG101、CD63和CD9,粒径分布集中在100～200 nm,平均粒径为175.2 nm。结论 腹腔注射巯基乙酸盐肉汤可提高小鼠原代腹腔巨噬细胞得率,ExoQuick TC外泌体试剂盒能够提取足量且纯度较高的小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体。     

1型单纯疱疹病毒经不同途径感染小鼠建立病理模型的比较分析

目的比较分析1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)经不同途径感染小鼠所建立的病理模型。方法将成年鼠分别经眼角膜、牙龈、鼻黏膜、皮下及尾静脉感染HSV-1,50μl/只,临床观察60 d,感染后第3和6天,取脑组织及脊髓,进行组织病理学观察,并检测病毒载量。将乳鼠经脑内和后肢注射感染HSV-1,10~7 CCID_(50)/(ml·g),临床观察2周,感染后第3天,取脑及后肢肌肉组织,进行组织病理学观察,并检测病毒载量。结果鼻黏膜组成年鼠感染20 d后,面部皮肤溃烂,眼角膜组感染47 d后,眼部出现红肿、充血;除尾静脉组和牙龈组外,其他组小鼠体重均呈升高趋势;未出现死亡情况。各组成年鼠脑组织和脊髓中均出现出血及炎性细胞浸润,感染后第3天脑中病毒载量最高。1、3、7日龄乳鼠经脑及后肢注射后均出现后肢麻痹症状,经脑部注射后死亡率分别为100%、100%和91.7%,经后肢注射后死亡率分别为90.9%、78.5%和72.7%。病毒感染后第3天,各组乳鼠均出现脑出血、血管袖套及少量炎性细胞浸润,个别乳鼠脑部见针迹灶;后腿肌肉仅见少量炎性细胞浸润现象,大脑和后腿肌肉组织中的病毒滴度为3.5~4.5 1og10CCID50/100 mg。结论乳鼠对HSV-1普遍易感,且病理损伤与成年鼠相似,本研究建立的乳鼠模型可用于疫苗株或减毒株的筛选和评价,为HSV-1疫苗的研发奠定了基础。     

抗衰老化妆品体外细胞水平上功效评价方法研究进展

从角质形成细胞模型抗衰老功效评价方法、成纤维细胞模型抗衰老功效评价方法以及三维皮肤模型抗衰老功效评价方法 3方面,综述了抗衰老化妆品体外细胞水平上功效评价方法。在培养的角质形成细胞、成纤维细胞及三维皮肤模型上对化妆品有效成分进行细胞学观察及关键指标分子生物学检测,这些技术对抗衰老产品的功效评价和研发具有广泛的应用价值。