TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用

目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高(10-2 ng/μl)、中(10-4 ng/μl)、低(10-6 ng/μl)浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数(CV)为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。     

磁珠分离结合定量PCR法检测单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量

目的利用磁珠分离法结合定量PCR技术,建立单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用。方法通过磁珠分离法提取样品中的残留DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行种属特异性、准确性及精密性验证,并对5个厂家15批单克隆抗体类产品中的残留DNA进行测定。结果该方法检测CHO细胞DNA残留的最低准确定量浓度可达1×10-3 pg/μl,DNA含量在1×10-3~102 pg/μl范围内曲线线性良好,标准曲线的相关系数为0.994;该方法能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属的DNA无扩增反应;该方法检测不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在90%以上,3次测定的相对标准偏差均小于20%,92.6%加标样品的DNA回收率在70%~130%之间;该方法检测15批单克隆抗体类产品的DNA残留量均小于100 pg/剂量,符合《中国药典》三部(2010版)有关CHO细胞残余DNA的要求。结论磁珠分离法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点,定量PCR法能够简便、快速、准确地对不同工艺的单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留进行定量测定。     

阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量

目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果 DNA标准品浓度为3～200 pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10. 812 x-36. 761,R2=0. 994 5;加入100和25 pg DNA标准品的样品回收率为88%～110%,CV分别为7. 7%和7. 4%;精密度各次检测CV均10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181. 9、104. 2和64. 6 pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和100 pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。     

荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗中残留DNA含量

目的采用荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量。方法采用《中国药典》三部(2010版)附录ⅨB荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺主要中间产品[丁基琼脂糖层析收集液(以下简称BA富集液)]、原液及半成品中残留DNA含量,对该方法的准确度、精密性进行验证,并用建立的方法检测10批BA富集液、原液及半成品中残留DNA含量。结果该方法线性范围1.25⁸0 ng/ml,r2≥0.999,最低检测限为1.25 ng/ml;DNA标准品在BA富集液、疫苗原液及半成品中的平均回收率分别为105.8%、101.4%和108.5%,准确度较好;不同时间点重复测定同一批样品的变异系数(CV)在1.6%80 ng/ml,r2≥0.999,最低检测限为1.25 ng/ml;DNA标准品在BA富集液、疫苗原液及半成品中的平均回收率分别为105.8%、101.4%和108.5%,准确度较好;不同时间点重复测定同一批样品的变异系数(CV)在1.6%⁶.56%之间,不同试验间重复测定同一批样品的CV在1.4%6.56%之间,不同试验间重复测定同一批样品的CV在1.4%³.6%之间,试验内和试验间精密性较好;10批BA富集液中DNA浓度均较高,经过纯化后,原液中DNA含量明显降低,半成品中除个别批号外,均基本达到低于10 ng/剂的要求。结论荧光染色法可用于重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量的常规监测,具有简便、快速、自动化程度高等特点,测定前样品无需进行处理。     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗外源DNA残留量检测方法的建立

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主DNA残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组DNA,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp和100~1 000 bp的基因组DNA超声随机小片段为模板,制备地高辛探针,与阳性对照进行杂交试验。同时验证方法的检测范围、灵敏度和特异性,并采用该方法对3批重组EV71 VLPs疫苗原液中宿主DNA残留量进行测定。结果纯化后DNA样品浓度为47. 5 ng/μL,A260/A280值为1. 86,可作为阳性对照。以100~1 000 bp DNA超声随机小片段作为模板,探针标记效率更高,杂交显色更清晰。该法检测范围为10 pg^10 ng,灵敏度达1 pg,特异性强。3批重组EV71 VLPs疫苗原液中每人份剂量的宿主细胞DNA残留均<50 pg。结论本实验建立的方法特异性强,灵敏度高,可用于重组EV71 VLPs疫苗制备过程中的原液检定及质量控制。     

两种Lowry法检测百日咳疫苗原液蛋白含量的比较

目的比较《中国药典》三部(2015版)收录的两种Lowry法测定百日咳疫苗原液蛋白定量的差异,为原液蛋白准确定量和新版药典Lowry法的适用性确认提供依据。方法 9个实验室分别按照现行药典收录的两种Lowry法,对4家15批百日咳疫苗原液蛋白含量进行测定。并与凯氏定氮法检测结果进行比较。结果方法 1(未经酸沉淀Lowry法)实验室内测定结果的变异系数(CV)均值在1.7%~8.9%之间,实验室间测定结果的CV值在3.9%~9.3%之间;方法 2(酸沉淀Lowry法)实验室内测定结果的CV均值在3.6%~7.4%之间,实验室间测定结果的CV值在3.9%~18.1%之间。同一样品两种方法测定结果差异有统计学意义(P0.001),结果呈相关性(R2=0.944 9)。在与部分样品测得的凯氏定氮法结果的比较中,方法 1差异有统计学意义(P0.001),方法 2差异无统计学意义(P0.05)。结论所有样品采用同一种Lowry方法测定时所得结果实验室内和实验室间一致性较好,采用方法 2测定结果明显低于方法 1,更接近凯氏定氮法结果真实值,表明酸沉淀对Lowry法百日咳原液蛋白定量有显著影响。与Lowry方法 1相比,Lowry方法 2更能准确反映百日咳疫苗原液的真实蛋白含量,且精密度、适用性均符合要求。     

Real-time PCR检测核酸疫苗中宿主基因组残留DNA

目的建立Real-time PCR方法,用于定量检测核酸疫苗中宿主基因组的残留DNA。方法以Lightcycler平台为基础,选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶标基因设计扩增引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光染料的Real-time PCR检测方法,并用于核酸疫苗纯化过程中间产物的检测。结果整个检测过程可在30min内完成,特异性强,检测灵敏度可达10fg/μl,其标准曲线的相关系数为-0.99。结论该方法可用于核酸疫苗中宿主基因组残留DNA的检测。     

两种测定生物制品宿主细胞DNA残留量方法的建立

目的建立特异性强、检测限低、准确度高的生物制品中宿主细胞DNA残留量的检测方法。方法通过优化,提高磁珠分离法和化学沉淀法提取样品中残留DNA的准确度,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR(quantitative PCR,q PCR)检测,分析样品中DNA残留量。对建立的两种检测体系进行专属性、精密度、准确度、耐用性验证,并确定两种方法的检测限和定量限。结果建立的q PCR体系标准曲线的相关系数(R2)均高于0. 99,能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属DNA无扩增反应。不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在60. 0%～140. 0%,3次测定的相对标准偏差(RSD)均小于30%。不同的退火温度反应条件下,RSD不大于30%。基于磁珠分离法的qPCR检测体系能检测出DNA残留浓度为5 pg/m L的DNA样品,定量限可达10 pg/mL;基于化学沉淀法的qPCR检测体系能检测出DNA残留浓度为0. 125 pg/m L的DNA样品,定量限可达1. 5 pg/mL。结论建立并优化了两种准确测定生物制品宿主细胞DNA残留量的处理样品方法,其中化学沉淀法检测限和定量限较低,更适合低浓度生物制品的样品处理。     

DNA生物传感器研究进展

在近年研究文献的基础上,对各种DNA生物传感器的原理、种类、应用以及发展前景进行了综述,引用文献34篇。     

质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较

目的对检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA含量的Southern blot和Real-time PCR法进行比较。方法PCR扩增宿主菌染色体DNA的16SrRNA片段,以地高辛标记回收的目的片段为探针,对提取的质粒pcDNAH进行Southern blot,同时根据16SrRNA基因序列设计探针,建立Real-time PCR反应体系和标准曲线,分别检测质粒中宿主菌基因组DNA的含量。结果应用Southern blot和Real-time PCR检测质粒pcDNAH中宿主菌基因组DNA的含量,结果均符合WHO相关标准。结论两种检测方法各有优缺点,均可用于检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA的残留,可根据不同情况,采用不同方法或配套使用。     

Electrochemical detection and discrimination of single copy gene target DNA in non-amplified genomic DNA

A sensitive, fast and inexpensive method for direct electrochemical detection of target DNA sequences in non-amplified genomic DNA samples is described. Hybridization detection relies on the alteration in guanine oxidation signal following hybridization of the probe with complementary genomic DNA. Initially, the method was tested to detect target DNA on low cycle number PCR amplicons. Having obtained promising detection results from only 5 cycles product, the feasibility of target sequence detection in extracted genomic DNA without PCR amplification, but with the vortex mediated fragmentation of the large genomic DNA into small pieces was examined. Experimental variables affecting the efficiency of sensor were investigated. Detection experiments with various non-complementary genomic DNAs as well as a proper probe, non-specific with respect to all genomic samples confirmed the excellent selectivity of the approach. The sensitivity of the method for analyzing the vortex mediated fragmentized genomic DNA samples is estimated to be approximately of 0.58 ng/μl.     

The role of DNA in PANI–DNA hybrid: Template and dopant

We exposed a novel method by using DNA as the dopant as well as template at the same time to prepare PANI–DNA hybrid micro/nanowires with conductivity as high as 10⁻² S cm⁻¹. The high conductivity is due to the co-doping function of DNA with HCl produced by FeCl₃. It is found that the morphology and conductivity of the PANI–DNA hybrids are affected by the [DNA]/[AN] ratio due to the co-operation and competition of DAN's dopant and template function, and the role of DNA in PANI–DNA hybrid varies with the changing of [DNA/[AN] ratios.