肺炎链球菌DnaJ蛋白的原核表达及其免疫保护效果

目的原核表达肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)热休克蛋白40(heat shock protein 40,HSP40,DnaJ),并探讨其免疫保护效果。方法从2、3、6B、14、19F、R6型肺炎链球菌基因组DNA中扩增DnaJ基因,插入原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-DnaJ,转化大肠埃西菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组DnaJ蛋白经Ni-NTA树脂纯化后,分别经腹腔和鼻黏膜免疫小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和唾液中特异性IgG和IgA抗体滴度;用重组蛋白刺激小鼠脾细胞,ELISA法检测细胞因子水平的变化;流式细胞术检测特异性抗DnaJ血清结合到肺炎链球菌表面的能力;检测抗DnaJ血清抑制R6型肺炎链球菌黏附A549细胞的能力。结果 6株肺炎链球菌的PCR扩增产物均可见1 119 bp的DnaJ基因片段,测序结果与GenBank中登录的序列一致;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;纯化的重组DnaJ蛋白相对分子质量约为38 000,纯度达90%以上,可与DnaJ小鼠免疫血清发生特异性反应。腹腔免疫DnaJ可使小鼠血清产生高滴度的特异性抗DnaJ抗体,鼻黏膜免疫DnaJ可增加小鼠血清和黏膜中抗DnaJ IgG和IgA抗体水平(P<0.01);鼻黏膜免疫DnaJ可使小鼠脾细胞释放高水平的细胞因子IL-10、IFNγ和IL-17A;抗DnaJ血清对肺炎链球菌具有更强的结合能力,且可抑制肺炎链球菌黏附肺癌上皮细胞A549。结论 DnaJ可诱导小鼠产生保护性免疫应答,提示其具有作为肺炎链球菌蛋白疫苗抗原的潜力。     

人呼吸道合胞病毒与结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性

目的在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性。方法将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTMHP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠。小鼠分为TB10.4(30μg/只)、TB10.4-F1(30μg/只)及PBS(200μl)组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1 d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度。结果表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13 300和59 600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9%和12%;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95%和80%;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699。结论融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体。融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。     

表皮生长因子受体-3真核表达质粒的构建及其免疫小鼠抗体滴度的检测

目的构建表皮生长因子受体-3(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3,ErbB3)真核表达质粒,并检测其免疫小鼠血清抗体滴度。方法以乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增ErbB3全长基因,插入pcDNA3.1-myc/His载体,构建重组表达质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3。同时以质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3为模板,PCR扩增ErbB3-ECD和ErbB3-RLD基因,插入pET-28a(+)和pGEX-KG载体中,构建重组表达质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD;将质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定后,经GST柱或镍亲和柱纯化,BCA法定量纯化后蛋白。以60μg质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3免疫BALB/c小鼠,4次免疫后,经小鼠尾静脉采血,分离血清,以纯化后的ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白为包被抗原,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度。结果 3种质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白ErbB3-ECD和ErbB3-RLD在相对分子质量约76 000和46 000处可见特异蛋白条带,浓度分别为2和1 mg/ml,免疫后的小鼠血清抗体滴度分别为1︰400和1︰10 000。结论 ErbB3全长质粒免疫BALB/c小鼠后,经ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白初步筛选,已获得ErbB3的多克隆抗体,为后期ErbB3单抗的制备以及以ErbB3为靶点的核酸免疫治疗奠定了基础。     

猪圆环病毒2b亚型Cap融合蛋白的原核表达及其免疫原性分析

目的原核表达猪圆环病毒2b亚型(porcine circovirus subtype 2b,PCV2b)Cap融合蛋白,并分析其免疫原性。方法以PCV2毒株(CAU0673)基因组为参考序列,His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的片段;将其产物克隆至pMAL-C4x载体中,构建pC4x-PCV2b-Cap重组质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行直链淀粉树脂纯化。SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性,Western blot检测其反应原性;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,Western blot检测小鼠血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pC4x-PCV2b-Cap构建正确;融合蛋白MBP-Cap(matlose binding protein Cap)最适诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,其以可溶性形式存在,相对分子质量约为81000,与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBPtag多克隆抗体及免疫小鼠抗血清均可发生特异性反应。结论成功构建了pC4x-PCV2b-Cap重组表达载体,获得了可溶性的MBP-Cap蛋白,其纯化蛋白具有较好的免疫原性。本文为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。     

大肠杆菌表达CRM_(197)及其在通用流感疫苗中的应用

利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达白喉毒素无毒突变体CRM_(197),经变性条件下亲和纯化后,作为蛋白载体与流感抗原M2e经BMPH偶联,制备CRM_(197)-M2e结合物,用其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法测定血清中M2e特异性IgG抗体.结果表明,重组CRM_(197)在大肠杆菌中成功表达,优化后蛋白表达量约为250±30 mg/L,纯度达95%以上;所制CRM_(197)-M2e结合物可有效免疫BALB/c小鼠,其刺激产生的M2e特异性IgG抗体滴度分别是健康组、M2e免疫对照组、CRM_(197)免疫对照组及CRM_(197)+M2e混合组的430.5,32,181和215倍.     

结核分枝杆菌Rv0057-Rv1352融合蛋白的制备及其初步应用

目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv0057-Rv1352融合蛋白,并通过化学发光酶免疫法分析其抗原性,以评价其应用价值。方法根据Rv0057和Rv1352蛋白序列,合成Rv0057和Rv1352基因片段并进行扩增,分别插入质粒pET30aSETB中,构建重组质粒Rv0057/pET30aSETB和Rv1352/pET30aSETB。用NheⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv1352/pET30aSETB,SpeⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv0057/pET30aSETB,将回收的Rv1352基因片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒中,构建重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的包涵体蛋白经His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化后,以其作为抗原建立化学发光酶免疫分析法,检测患者血清中抗结核抗体,并与市售M.tb抗体诊断试剂盒和痰涂片法进行比较。结果构建的重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB的核苷酸序列与设计序列完全一致;表达的重组融合蛋白Rv0057-Rv1352相对分子质量约为30 500,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组融合蛋白的浓度为1.6 mg/ml,纯度为95%;以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测患者血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性分别为66.70%和90.00%,而市售M.tb抗体诊断试剂盒的灵敏度和特异性分别为80.00%和63.33%;30例活动性肺结核患者经痰涂片检测,灵敏度为20.0%,化学发光酶免疫分析法检测灵敏度为66.7%,二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了M.tb Rv0057-Rv1352融合蛋白,以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测抗结核抗体具有较高的灵敏度和特异性,在结核病血清学快速诊断方面具有广阔的应用前景。     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达、纯化狂犬病病毒(Rabies virus,RV)核蛋白(Nucleoprotein,NP),并检测其免疫原性。方法 RT-PCR扩增RV CVS-11株NP全长基因序列,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-N,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni2+柱亲和层析纯化后,进行Western blot分析,并分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平。结果重组原核表达质粒pET-30a-N经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约51 800,表达量约占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RV小鼠血清特异性结合,分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体滴度对数的GMT值(3.81±0.22和3.68±0.20)明显高于阴性对照组(1.25±0.22),且差异均有统计学意义(P<0.01)。结论已成功表达并纯化了RV NP,其免疫原性良好,为进一步研究其功能奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC_007795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mAT相对分子质量约为34 000,以可溶性形式表达。纯化的重组蛋白mAT可诱导小鼠产生滴度为1∶580 000的IgG抗体,且以IgG1亚型(抗体滴度为1∶440 000)为主。试验组小鼠对49521 3次攻毒的保护率分别为75.0%、70.0%和83.3%,对49525菌的保护率分别为80.0%、60.0%和80.0%,均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论金葡菌无毒性重组蛋白mAT具有较好的免疫原性和免疫保护作用,可作为多抗原组分疫苗研究的候选抗原。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在CHO细胞中的表达及其免疫学特性

目的在CHO细胞中表达Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus-2,HSV-2)糖蛋白D(Glycoprotein D,gD),并检测其免疫学特性。方法采用Vero细胞培养HSV-2,提取总DNA,以其为模板,PCR扩增gD基因,与pCMV-sport载体连接,构建重组表达质粒pCMV-gD,将质粒pCMV-gD转染COS-7和CHO-K1细胞,并进行表达。亲和胶Anti-flag M2 Agarose纯化表达蛋白,经SDS-PAGE和HPLC分析重组蛋白纯度,Western blot分析蛋白反应原性,全波长扫描分析蛋白的光谱曲线,等电聚焦电泳测定蛋白的等电点。以20、40μg纯化的gD免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中HSV-2 gD特异性抗体水平,中和试验测定小鼠血清中和抗体水平。结果酶切鉴定及DNA测序表明,重组表达质粒pCMV-gD构建正确,在COS-7细胞的瞬时表达产物和CHO细胞中的稳定表达产物均可被HSV-2 gD单抗特异性识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。纯化的gD在相对分子质量约5 500处可见目的蛋白条带,纯度为65.46%;保留天然HSV-2 gD的反应原性,最适紫外吸收波长为275.50 nm,等电点为8.3。gD 20μg组和40μg组小鼠血清特异性抗体滴度分别为1∶125 000和1∶16 000,中和抗体滴度分别为1∶17和1∶16,表明gD可诱导中和抗体的产生,也可诱导高滴度的HSV-2gD特异性抗体。结论成功在CHO细胞中稳定表达了HSV-2 gD,表达的HSV-2 gD具有较好的免疫原性,为基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

重组SARS病毒N蛋白的制备及其初步应用

目的在大肠杆菌中表达重组SARS-CoVN蛋白,并进行纯化,为进一步研制SARS早期诊断试剂奠定基础。方法通过RT-PCR获得SARS-CoVN蛋白基因片段,并克隆至大肠杆菌表达载体pQE30中,构建重组质粒。转化E·coliM15,IPIG诱导表达。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,采用Chelating-Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,并免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平。结果所构建的重组表达载体pQE30-N经诱导可表达重组SARS病毒N蛋白。该蛋白纯化后,纯度可达90%左右。Western blot检测表明,重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者恢复期血清呈现特异的免疫反应。免疫BALB/c小鼠可获得高效价抗血清。结论重组SARS-CoV N蛋白具有良好的抗原性,可用于SARS-CoV感染的早期诊断。     

梅毒螺旋体特异性抗原TpN47基因片段的克隆与表达

目的在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp)TpN47(68~410 aa)重组蛋白。方法采用PCR法从Tp全基因组中扩增TpN47(202~1230 bp)片段,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47,经酶切鉴定后转化EcoliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,Western blot鉴定其免疫反应性。结果PCR法扩增出约1 000 bp的目的片段,原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47经酶切鉴定正确,表达的蛋白约占菌体总蛋白的43%,相对分子质量约为39 000,以包涵体形式存在。经纯化后蛋白纯度达95%以上,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TpN47重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒奠定了实验基础。     

埃可病毒6型表面特异性抗原VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达埃可病毒6型表面特异性蛋白VP1,并制备其多克隆抗体。方法筛选VP1蛋白氨基酸序列中抗原性强的片段,优化基因序列,分别构建重组表达质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1。将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行15%SDS-PAGE鉴定。将融合蛋白VP1-GST及VP1-His分别用Glutathione resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化。以纯化后的VP1-His融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,以VP1-GST融合蛋白为检测抗原,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定证明,重组质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1构建正确。VP1-GST和VP1-His融合蛋白的相对分子质量分别为38 000和19 000,两种融合蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的60%和30%,纯化后的纯度均90%。兔抗VP1血清效价为1∶320 000,可与融合蛋白VP1-GST和VP1-His发生特异性结合。结论成功原核表达了融合蛋白VP1-His和VP1-GST,且VP1-His具有良好的免疫原性,其制备的多克隆抗体的特异性较好,为埃可病毒快速检测技术的建立奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果

目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。     

A群链球菌四价重组蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法(IFA)检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。     

B族链球菌C5a肽酶表位的预测、分段表达及其免疫原性

目的应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白(SCPB)的表位,分段表达其中4个功能活性区域,并分析其免疫原性。方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测SCPB的表位;分别构建C5a肽酶4个目的片段的重组表达质粒,经酶切测序正确后,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量;并经镍柱亲和层析纯化,纯化的重组蛋白进行蛋白质谱分析和Western blot分析后,皮下免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清抗体水平。结果经预测,SCPB含1个既可结合MHC又具有B细胞表位特征的肽段。构建的4个重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,目的蛋白主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%～70%。纯化的重组蛋白纯度可达90%,质谱分析表明与SCPB的相似性很高;Western blot分析表明,可与兔抗全长SCPB多克隆抗体反应。重组F1、FE、Fn蛋白免疫小鼠血清抗体滴度较高,三者差异无统计学意义;F2a蛋白抗体滴度最低,与F1、FE和Fn蛋白差异有统计学意义。结论已成功构建并高效表达了SCPB的4个功能活性区域;Fn是重要的免疫优势表位功能区;本文为B族链球菌毒力机制的研究及亚单位蛋白疫苗的研制奠定了基础。     

以乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒为载体的流感通用疫苗的构建

目的构建以乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus coreprotein,HBc)颗粒为载体的含流感病毒M2基质蛋白胞外功能区(M2 ectodomain,M2e)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)保守表位的流感通用疫苗,评价其抗不同亚型流感病毒感染的保护作用。方法采用基因工程方法将流感病毒M2e的3拷贝重复片段与NP的CTL表位串联,插入HBc刺突顶端的免疫优势决定区,构建重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG16℃低温诱导表达。表达的融合蛋白HBc-3M2e-NP经纯化后,电镜观察病毒样颗粒形成情况。纯化的融合蛋白分别经鼻腔和腹腔免疫小鼠,对照组注射等体积的PBS,间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体水平;流式细胞术检测小鼠脾组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平;以流感病毒攻毒,检测融合蛋白的保护效果。结果重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为29000,以包涵体和可溶性两种形式表达,且可与鼠抗M2e单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度大于90%,且能够自动装配成病毒样颗粒。用该病毒样颗粒免疫小鼠,可诱导小鼠产生针对不同流感病毒毒株的特异性抗体;2种途径免疫的小鼠脾组织中CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例均较对照组明显升高;攻毒试验结果显示,具有交叉保护作用。结论构建的流感通用疫苗能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答及有效的交叉保护作用,为流感通用疫苗的深入研究奠定了基础。