分段通气对Klebsiella pneumoniae生产1,3-丙二醇关键酶和辅酶的影响

通过考察1,3-丙二醇合成中关键酶、辅酶的变化,研究了分段通入空气对Klebsiella pneumoniae厌氧发酵生产1,3-丙二醇的影响. 与对照组相比,在发酵前期(12 h)通入空气4 h后,甘油脱氢酶酶活提高1.5倍,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活提高18%,1,3-丙二醇浓度提高16%;发酵后期(28和48 h)通入空气后,甘油脱氢酶酶活不变,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活下降,1,3-丙二醇浓度降低. 发酵前期,通气对辅酶NADH和NAD的浓度无影响;发酵后期,菌体生长停滞,辅酶的浓度也随之下降.     

发酵产1,3-丙二醇的关键酶研究进展

1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一种重要的化工原料.综述了微生物法生产1,3-丙二醇的关键酶相关研究成果,包括1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶等,并进行了展望.     

控制氮源浓度提高1,3-丙二醇的发酵水平

通过对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)甘油发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)发酵过程的研究发现,氮源浓度对菌体生长、产物和副产物的代谢有着重要影响.氮源浓度较低时,菌体生长和产物生成都会因氮源不足受到影响;氮源浓度较高时会导致菌体过度生长和副产物的大量生成,降低1,3-PD的最终浓度和甘油到1,3-丙二醇的转化率.控制合适的氮源浓度可以提高1,3-PD的发酵水平,1,3-PD的最终浓度达到61.20 g·L-1、甘油到1,3-丙二醇的转化率达到0.72 (mol·mol-1),分别比对照提高了10%和20%.     

途径工程生产1,3-丙二醇的研究进展

利用基因工程技术生产1,3-丙二醇,特别是途径工程的利用已取得了重大突破。利用生物技术生产1,3-丙二醇的成本比化学法的低25％,它将逐步实现工业化生产。介绍了一步法生产1,3-丙二醇的超级基因工程菌所需的3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)、甘油3-磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶(dhaB)和1,3~丙二醇氧化还原酶(dhaT),并对关键酶dhaB进行了分析,同时介绍了穿梭质粒和甘油-3-磷酸酶积累对生产的影响。最后,对今后的研究重点和策略进行了探讨。     

丁酸梭杆菌VPI 3266甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的克隆、表达

对丁酸梭杆菌VPI 3266的1,3-丙二醇代谢途径关键酶甘油脱水酶(DhaB)与1,3-丙二醇氧化还原酶(DhaT)进行了研究。甘油脱水酶基因dhaB全长3315bp,编码两个蛋白亚基,分别为甘油脱水酶的核心酶和脱水酶的再激活酶。前者全长2367bp,编码788个氨基酸,后者全长918bp,编码305个氨基酸。通过构建重组质粒,使其在大肠杆菌中实现了活性表达。1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT全长1166bp,编码388个氨基酸,属于NADP依赖的离子激活的醇脱氢酶家族III。通过IPTG诱导,在大肠杆菌中实现了高效表达,酶活达到5.2U/mL。并通过Ni亲和柱获得了电泳纯的蛋白。蛋白相对分子质量为4.19×10⁴。该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为10.0,在pH值8.5~10.0范围内比较稳定,在45℃保温2h,酶活还残存50%。该酶以1,3-丙二醇为底物,在生理条件下的V_max和K_m分别为29.2U/mg和19.8mmol/L。     

氧对Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇代谢的影响

考察了氧对Klebsiella pneumoniae发酵产1,3-丙二醇(PDO)代谢的影响. 研究结果表明,在厌氧或供氧条件下,K. pneumoniae都能利用甘油产PDO. 起始甘油浓度20 g/L,发酵时间4 h,在充分供氧条件下,PDO产量仅为1.1 mmol/L;但在微量供氧条件下,PDO产量为16 mmol/L,是厌氧发酵时的1.28倍. 在微量供氧条件下,调控PDO合成的关键酶甘油脱氢酶、甘油脱水酶及1,3-丙二醇氧化还原酶的活性分别为7.28, 1.14, 0.52 U/mg,高于厌氧或充分供氧条件下的相应酶活性. 氧对细胞内NADH的合成也有影响,厌氧及微量供氧条件下菌体内NADH含量分别为3.78及3.72 μmol/g (DCW),高于充分供氧发酵时的0.85 μmol/g (DCW).     

工程菌发酵产酶及其在1,3-丙二醇耦合酶催化制备中的应用

培养定向进化后的质粒保藏菌E.coli BL21(DE3)pLysS/PET-15b-dhaT’-24并进行质粒抽提,将抽提的质粒转化入感受态宿主细胞E.coli BL21(DE3)pLysS中得产1,3-丙二醇氧化还原酶的工程菌。工程菌经乳糖诱导后进行发酵培养获得酶活为182 U/mL的1,3-丙二醇氧化还原酶,最适反应pH值为10,pH值稳定范围为7.0～9.0,最适反应温度为55℃,温度稳定范围为30～45℃。利用工程菌产的1,3-丙二醇氧化还原酶进行转化3-羟基丙醛为1,3-丙二醇的反应,同时偶联甘油脱氢酶(由另一工程菌制备)转化甘油的反应进行辅酶NADH的再生,实现了1,3-丙二醇的双酶耦合的连续反应。由于来源于工程菌的双酶酶学性质相适应,反应连续进行34 h后,底物3-羟基丙醛的转化率达63.4%,产物1,3-丙二醇的产率达64.6%。     

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌JM109（pHsh-dhaB-yqhD）的构建及其转化甘油

利用温控载体pHsh将编码甘油脱水酶的基因dhaB和编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD串联构建重组质粒pHsh-dhaB-yqhD, 将其转化大肠杆菌得到新型产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD), 并对影响该重组菌发酵的营养因子进行研究.实验结果表明：该重组菌转化甘油合成1,3-丙二醇的适宜培养基组成为甘油60 g·L^-1、酵母膏5.0 g·L^-1、维生素B₁₂ 0.05 g·L^-1以及KH₂PO₄ 7.5 g·L^-1; 以此培养基在5 L发酵罐上进行放大, 1,3-丙二醇产量、转化率和生产能力分别达到43.26 g·L^-1、72.2 %和1.55 g·L^-1·h^-1.     

肺炎克雷伯氏菌生物合成1,3-丙二醇的副产物调控研究

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955为原始菌株,利用代谢工程手段对K.pneumoniae生物合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的副产物进行调控.通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到83.8 g·L-1,生产强度提至2.79 g·L-1·h-1;进一步结合乙酸吸收途径强化,有效解除了乙酸溢流现象,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到94.9g·L-1,生产强度提至3.16 g·L-1·h-1.研究表明,通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因结合乙酸吸收途径强化能够促进1,3-PD的合成,减少副产物的产生,提高K.pneu-moniae 代谢甘油合成1,3-PD的产量和生产强度.     

甘油和木糖共发酵生产1,3-丙二醇的研究

以克雷伯氏肺炎杆菌代谢甘油为研究对象,采用木糖作为发酵过程中的辅助底物与甘油共发酵生产1,3-丙二醇,以解决甘油单耗过大的问题,并研究了甘油和木糖共发酵过程中相关代谢物浓度的变化规律。实验表明:克雷伯氏肺炎杆菌可利用D-木糖经过磷酸戊糖途径为菌体代谢提供大量的还原力(NADPH和NADH),促进1,3-丙二醇的合成。与甘油单独发酵相比,以木糖作为辅助底物的微氧批次补料发酵中,1,3-丙二醇的质量浓度、甘油转化率及产量分别提高了10.58%,21.11%和10.98%。共发酵生产1,3-丙二醇在降低甘油到1,3-丙二醇单耗的同时,还可以促进副产物的生成,为克雷伯氏菌发酵多联产工艺提供了可能,从而较全面地降低甘油发酵生产1,3-丙二醇工艺的技术成本,具有一定的研究意义。     

巴氏梭菌高产1，3-丙二醇菌株诱变选育

1,3-丙二醇（1,3-PD）主要应用于油墨、涂料、化妆品、制药、防冻剂等行业．它最重要的用途是作为聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。由它合成的聚酯,如聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）,有独特的性质和优异的性能,而且可以使聚酯塑料具有易于自然循环的可生物降解特性闭。目前,1,3-丙二醇的生产主要是以石油裂解的乙烯和丙烯为原料．在高温和重金属催化剂的作用下化学合成的。这种合成方法使用有毒的化合物．性质相近的副产物较多,导致分离纯化困难。生产成本相应较高。与化学合成法相比,生物制备法具有以下优点：采用了成本较低的再生资源．生产条件温和,节约能源,无需贵重金属催化剂,转化率高,选择性好．副产物少,易于分离纯化,环境友好等目。     

能量驱动对Klebsiella pneumoniae发酵甘油合成1,3-丙二醇的影响

考察了外加能量对Klebsiella pneumoniae合成1,3 丙二醇的影响,结果表明,外加0.6 0.8 g/L三磷酸腺苷 ATP 可以有效促进Klebsiella pneumoniae发酵甘油的还原代谢,1,3 丙二醇产量提高了50 70 ,得率在发酵后期仍能维持在较高水平. 利用休止细胞研究了甘油脱水酶催化失活后能量刺激复活的情况,结果表明外加三磷酸腺苷(ATP)对休止细胞中甘油脱水酶的复活有明显的驱动作用,经多次失活/驱动复活后甘油脱水酶活性可维持不变.     

甘油连续生物歧化过程培养基和pH调控策略研究

设计了三种不同的培养基和三种pH调控方式,考察了钠、钾和铵离子对甘油连续生物歧化过程的影响,从代谢调控的角度分析了连续发酵实验结果。研究表明,用氢氧化钠调节pH将对底物过量条件下甘油代谢途径中的甘油脱氢酶产生抑制作用,使生物量和1,3－丙二醇的产率下降。在培养基含有足够铵的情况下,可以用氢氧化钾控制pH。采取无铵培养基和氨水并用的策略是可行的。     

外源添加ATP对K.pneumoniae菌体生长和产物合成的影响

基于K.pneumoniae生成1,3 丙二醇过程中甘油脱水酶催化失活与复活的特性,在发酵培养基中添加不同质量浓度的三磷酸腺苷(ATP),考察ATP对菌体生长、1,3 丙二醇(1,3 PD)、其他副产物合成的影响。实验结果表明:添加ATP抑制菌体生长,加入质量浓度为0 4g/LATP,OD值比参照低53%;添加ATP促进单位细胞合成1,3 丙二醇,加入质量浓度为0 4g/LATP,1,3 丙二醇质量浓度/OD值比参照高90%;添加ATP能提高甘油到1,3 丙二醇转化率,加入0 8g/LATP,甘油到1,3 PD的最大转化率达到0 76mol/mol。     

克雷伯氏杆菌发酵生产1,3-丙二醇的代谢通量优化分析

以克雷伯氏杆菌为研究对象,系统研究了1,3-丙二醇厌氧和微氧代谢途径.采用代谢通量分析法建立了代谢通量平衡模型,通过线性规划对1,3-丙二醇厌氧和微氧发酵进行了优化分析,得到其最优代谢通量分布和最大理论得率,并分析了比生长速率、底物浓度以及乙醇生成速率、氧气消耗速率、呼吸商对1,3-丙二醇得率的影响.     

若干因素对发酵法生产1,3-丙二醇的调控作用

利用一株新筛选的克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae ZJU 5205)对发酵法生产1,3-丙二醇进行了研究,考察了 pH、溶氧及添加辅助底物葡萄糖对发酵过程的调控作用。实验结果表明,相比于未调控 pH 发酵,恒定 pH 值发酵得到的菌体浓度明显增高,甘油消耗加快,1,3-丙二醇的最终浓度以及甘油到丙二醇的转化率(Y_(P/S))明显提高,分别达16.39g/L和0.51mol/mol;厌氧发酵时的菌体浓度和甘油消耗速率均高于微氧发酵,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率低于微氧发酵;添加葡萄糖为辅助底物能够有效促进菌体生长,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率却低于以甘油为单一底物时的发酵结果。     

醛脱氢酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇的影响

利用Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇时，一部分甘油通过氧化代谢途径大量合成副产物乙醇，降低了1,3-丙二醇的得率.醛脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为NAD⁺，降低了同为NADH依赖型的1,3-PD合成途径的效率.本文以醛脱氢酶ALDH为改造目标，以K.pneumoniae为宿主，通过同源重组技术在K.pneumoniae M5aL的ALDH基因中成功地插入了四环素抗性基因，经抗性筛选和基因水平鉴定，得到两株ALDH基因敲除的重组菌0623-1hb及0623-1hc.本文研究了这两株重组菌的生长代谢特性，结果表明两株重组菌的ALDH酶活基本检测不到，菌体生长受到明显抑制，乙醇合成浓度比出发菌株K.pneumoniae M5aL降低了43%～53%，1,3-PD合成浓度及摩尔得率分别提高了27%～42%和19%～24%.