Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液蛋白成分分析

目的 对本公司研发的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液进行蛋白成分分析及鉴定。方法 按照疫苗生产工艺,应用NBS篮式生物反应器生产单价脊髓灰质炎病毒原液,经超滤浓缩及分子筛和阴离子交换两步柱层析纯化方法,收集并灭活蛋白峰。透射电镜下观察病毒形态及大小;ELISA方法检测宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)及残留牛血清白蛋白含量;HPLC法分析单价灭活病毒纯化液纯度;液相色谱(liquid chromatography,LC)与电喷雾电离质谱(electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS)相结合的技术鉴定样品中所含蛋白成分。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液中可见球形病毒颗粒,直径25~30 nm;HCP、残余牛血清白蛋白含量分别低于50 ng/ml、2.5μg/ml;纯度大于95%;单价脊髓灰质炎病毒样品中含有相应血清型的脊髓灰质炎病毒基因组编码蛋白,且相应病毒蛋白成分数据库匹配相对分值在所含蛋白组分中均最高。结论 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒液经纯化后,有效去除了杂质蛋白保留了病毒蛋白组分,单价病毒纯化液病毒蛋白成分明确,纯度较高,为后续该疫苗的研发与生产提供了参考。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性

目的探讨Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性。方法用Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分别以0.01、0.1和1MOI接种Vero细胞,进行传代培养,共传13代。采用微量细胞病变法测定病毒滴度;双抗体夹心法测定D抗原含量;免疫Wister大鼠,采用微量中和试验测定病毒的免疫原性。结果Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在Vero细胞上连续传13代,病毒滴度基本稳定;D抗原含量呈下降趋势;免疫原性下降迅速。结论用Sabin株脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗,在Vero细胞上传代的代次越低越好。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗纯化工艺的建立

目的建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)纯化工艺。方法采用Sepharose CL-6B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析两步纯化法纯化脊髓灰质炎病毒,进行各项检定后再经除菌过滤和灭活。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒纯化后的蛋白去除率均不低于98.81%,病毒滴度分别为8.75、8.50和8.63lgCCID50/ml,DNA残留量均<100pg/ml。除菌过滤和灭活后,D抗原含量略有下降。结论已建立了Sabin株IPV的纯化工艺,纯化后制备出了高纯度的Sabin株IPV。     

生物反应器微载体系统培养Sabin株脊髓灰质炎病毒条件的优化

目的优化生物反应器微载体系统培养Sabin株脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)的条件,以提高Sabin株PV产量。方法应用搅拌式生物反应器培养PV,对其进行Vero细胞培养密度、病毒培养温度及病毒接种MOI条件的优化,收获病毒液后,检测病毒D抗原含量和感染性滴度,并进行全基因组深度测序。结果 9.0 g/L微载体培养Vero细胞得到病毒D抗原含量显著高于低微载体浓度培养结果(P0.01);病毒D抗原含量在34℃培养时最高(P0.01);病毒D抗原含量在MOI 0.050接种时最高(P0.05),MOI 0.010和MOI 0.005时无明显差异。SabinⅠ型480、525和Ⅲ型Pfizer株472、2 493位点突变率随着细胞培养密度(微载体浓度)的增加而增加;提高病毒培养温度以及改变病毒MOI,大多数毒力相关位点突变率无明显变化。结论提高细胞培养密度、以MOI 0.050接种病毒以及34℃培养病毒均有利于提高病毒产量。     

二乙烯亚胺灭活流感病毒的效果观察

目的观察二乙烯亚胺(BEI)对流感病毒的灭活效果。方法分别使用甲醛和BEI对流感病毒进行灭活试验,通过血凝试验检测二者灭活效果,并确定各自最佳灭活时间。用灭活的病毒液免疫小鼠,检测其抗原性,并用RT-PCR方法分析灭活病毒基因组的完整性。以裂解剂TritonX-100裂解病毒后,分别加入甲醛和BEI灭活,采用单向免疫扩散法检测灭活不同时间病毒液的HA含量。结果BEI灭活36h可将病毒完全灭活;BEI灭活的病毒免疫小鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体;BEI灭活病毒液经RT-PCR,不能扩增出病毒基因;BEI灭活病毒的HA平均含量比甲醛灭活病毒的HA平均含量略高。结论BEI在灭活流感病毒感染性的同时,能够灭活病毒基因,并较好地保持病毒的抗原性。     

脊髓灰质炎病毒Sabin株工作种子批基因鉴别

目的研究脊髓灰质炎病毒Sabin株基因鉴别的方法。方法分别进行脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ型Sabin株和Ⅲ型Pfizer株3个型的工作种子批病毒RT-PCR,对扩增产物进行SDS-PAGE及测序。结果Ⅰ、Ⅱ型Sabin株和Ⅲ型Pfizer株3个型的工作种子批病毒分别出现了97、71和53bp的电泳带,与预期结果相符。扩增基因序列与报道的脊髓灰质炎病毒减毒株序列一致。结论RT-PCR可以用于脊髓灰质炎病毒Sabin株毒株鉴别。     

乙型脑炎病毒的生物反应器培养及其灭活和纯化

目的利用NBS 14 L篮式生物反应器大规模培养乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),并对病毒收获液进行灭活和纯化,为乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)的大批量生产提供参考。方法用NBS 14 L篮式生物反应器,以片状载体FibralCel DISKⅠ为载体,进行Vero细胞高密度培养,分别按0.01、0.1和0.3 MOI接种JEV(P3V2)毒种,灌流培养,收获3批病毒液,检测病毒滴度;分别使用不同浓度的甲醛(100、200、400 ng/ml)于4、25℃和不同浓度的β-丙内酯(β-丙内酯︰病毒液分别为1︰2 000、1︰4 000、1︰8 000)于4℃对病毒收获液进行灭活,取灭活后的病毒液,接种昆明小鼠,验证病毒灭活效果;用截留相对分子质量为10万的超滤器对病毒收获液进行超滤浓缩,用Sepharose 4FF层析柱对病毒浓缩液进行层析纯化。结果共培养3批Vero细胞,平台期密度约为1.6×107个/ml。3批病毒收获液的滴度分别为8.4、8.1和7.9 lgLD50/ml。以甲醛为灭活剂,作用浓度为200 ng/ml,温度为4℃时,作用7 d可完全灭活病毒,且免疫原性合格;以β-丙内酯为灭活剂,作用浓度为1︰4 000,温度为4℃时,作用12 h可完全灭活病毒,且免疫原性合格。3批病毒浓缩液病毒液经Sepharose 4FF层析柱层析纯化后,蛋白去除率达99%以上,抗原回收率在95%以上,Vero细胞蛋白质残留量和DNA残留量均符合《中国药典》三部(2010版)的相关规定。结论成功实现了JEV的大规模生物反应器培养,层析纯化后病毒的抗原回收率较高,为乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)的大批量生产提供了参考。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗D抗原国家标准品的建立

目的制备Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗D抗原国家标准品,并进行协作标定及稳定性检测。方法委托中国医学科学院医学生物学研究所按照国家批准工艺制备分装三价候选国家标准品,并考察其均匀性;组织5家实验室采用统一的D抗原ELISA检测方法对候选标准品协作标定,确定D抗原标示值,并对其稳定性进行初步检测。结果候选标准品分装精度变异系数(CV)为0.21%;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型CV值分别为7.39%、6.21%、7.75%;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在不同实验室间D抗原含量的CV值分别为4.03%~5.90%、3.48%~4.00%、3.03%~4.53%,抗原含量均一性良好;确定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型最终标准品效价分别为180、191、243 DU/m L。将标准品于4及-20℃放置4个月,3个血清型的D抗原含量均未发生较大变化;25℃放置约7周时,各血清型D抗原含量才出现下降趋势;37℃放置1周时开始下降,尤以Ⅰ型最为明显。结论制备的候选标准品满足国家生物标准物质的要求,可应用于Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗体外效力检测。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性

目的分析Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine,sabin strain,s IPV)毒种(亚主种子、工作种子)及疫苗代次病毒(SO+4)的遗传稳定性。方法比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒的感染性滴度及D抗原含量的变化情况,并对上述病毒进行全基因组测序。结果各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62~8.62 lg CCID50/ml,D抗原含量均维持在30~128 DU/ml。与Gen Bank上登录的SabinⅠ(AY184219.1)、Ⅱ(AY184220.1)、Ⅲ型(AY184221.1)减毒株原始种子(SO)基因序列相比,Sabin株亚主种子(SO+2)、工作种子(SO+3)及疫苗代次病毒(SO+4)均未出现碱基突变。结论 s IPV毒种及疫苗代次病毒的全基因序列与原始种子相比,均未发生变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性。     

脊髓灰质炎病毒冻干保护剂的筛选

目的筛选脊髓灰质炎病毒冻干保护剂。方法将不同配方的冻干保护剂与脊髓灰质炎病毒(SabinⅠ型、SabinⅡ型及中Ⅲ2型)混合,进行冻干,并检测冻干前后病毒感染性滴度及冻干后的热稳定性。结果经检测发现,第Ⅷ组配方(海藻糖8%、人白蛋白1%、山梨醇5%、明胶0·5%和甘氨酸1%)在脊髓灰质炎病毒的冻干过程中保护作用较好。冻干前后感染性滴度下降在0·5LgCCID50/ml以内,且热稳定性好,37℃放置1周后SabinⅠ型、SabinⅡ型及中Ⅲ2型病毒的感染性滴度平均下降分别为0·2、0·3和0·4LgCCID50/ml,而相应对照组的感染性滴度平均下降分别为1·1、1·1和1·3LgCCID50/ml,二者差异有显著意义(P<0·05)。结论含有海藻糖、人白蛋白、山梨醇、明胶和甘氨酸的保护剂对脊髓灰质炎病毒冻干具有良好的保护效果。     

细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用

目的采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15 L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100%时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50/ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10CCID50/ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50/ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50/ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2 d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10CCID50/0.1 ml,于2~8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒经透析处理后病毒回收效果评价

目的采用透析法对Sabin株3个型别的脊髓灰质炎病毒收获液进行透析后的病毒回收效果评价。方法高病毒滴度时,对Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液分别进行透析,比较每个型别病毒收获液透析前后的病毒感染性滴度回收率,及透析后的甲醛清除率;低病毒滴度时,选取101、100、10-1 CCID_(50)/mL 3个滴度的Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒液,分别进行透析,将相同型别及滴度的透析前后样品接种至Hep-2细胞上进行3次传代,比较透析前后细胞病变比率及病毒滴度。结果高病毒滴度时,各型别病毒收获液透析后与透析前相比,样品体积和感染性滴度均未发生较大变化(P0.05),透析后甲醛清除率达99%以上。101 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,各型别病毒3次传代均能100%引起细胞病变;100 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒第1次传代引起细胞病变比率分别为66%、33%和33%,第2、3次传代均能100%引起细胞病变;10-1 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,3个型别病毒3次传代均不能引起细胞病变。所有细胞病变后检测病毒滴度均在6.0 lgCCID_(50)/mL以上。结论 Sabin株3个型别的病毒收获液经透析后,活病毒的回收率较高,基本无损失,透析法可作为该病毒的纯化方法。     

两种凝胶过滤介质纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒效果的比较

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗原及蛋白含量,计算比活性、蛋白去除率及抗原回收率,确定病毒峰收集范围。取抗原含量最高的病毒收获液,利用DEAE Sepharose FF离子交换填料进行纯化后,检测Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量。结果 Sepharose 6FF填料按6%柱体积上样进行凝胶纯化,纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液抗原回收率均值分别为78.69%、78.03%和78.37%,与Sepharose CL-6B填料按3%柱体积上样(77.29%、78.60%和77.36%)相比,差异无统计学意义(P0.05)。两种填料纯化的各型收获液再经离子交换纯化后,蛋白去除率、比活性、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,两种填料纯化的各型收获液比活性差异无统计学意义(P0.05)。结论使用Sepharose 6FF纯化的各型病毒纯化液抗原回收率和比活性与Sepharose CL-6B无明显差异,但可以减少纯化的上样次数,大幅提高纯化效率,可用Sepharose 6FF替换Sepharose CL-6B。     

感染复数对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响

目的观察不同感染复数(MOI)对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响。方法分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒感染Vero细胞,观察不同MOI致细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果病毒感染Vero细胞后48h,3组MOI(0.001、0.01、0.1)细胞病变均达莞。Ⅰ型病毒增殖高峰出现在接种后72h,3组MOI病毒滴度分别为(8.690±0.190)、(8.690±0.190)和(8.315±0.185)lgCCID50/ml;Ⅱ型病毒增殖高峰出现在接种后96h,3组MOI病毒滴度分别为(8.355±0.097)、(8.440±0.310)和(8.285±0.155)lgCCID50/ml;Ⅲ型病毒增殖高峰出现在接种后48～96h,3组MOI病毒最高滴度分别为(7.500±0.250)、(7.500±0.250)和(7.750±0.250)lgCCID50/ml。结论不同MOI对3型病毒增殖影响不大,可以采用低MO(I0.001)制备疫苗。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗在动物体内的免疫原性及安全性评价

目的评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliovirus vaccine derived from Sabin strain,s IPV)在动物体内的免疫原性和安全性。方法利用篮式生物反应器在Vero细胞上培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,收获病毒液,经超滤浓缩、柱层析纯化、病毒灭活后,制备三价s IPV,参考《中国药典》三部(2010版)相关附录方法检测宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、宿主细胞DNA及牛血清白蛋白残留量,HPLC法检测纯度;采用SDS-PAGE、Western blot法及透射电子显微镜对病毒的特异性进行鉴定;将s IPV于第0和21天免疫Wister大鼠,微量中和法检测免疫后大鼠血清中和抗体水平,并与野毒株IPV(IPV derived from wild strain,w IPV)组进行比较;通过观察ICR小鼠单次肌肉和静脉注射给予s IPV后产生的毒性反应及豚鼠反复给予s IPV后出现的速发型全身过敏反应,评价疫苗的安全性。结果 s IPV残余牛血清白蛋白、宿主细胞DNA、HCP检测结果分别低于2.5 ng/ml、100 pg/ml和100 ng/ml,疫苗纯度达95%以上;病毒形态及直径大小与脊髓灰质炎病毒一致,兔抗脊髓灰质炎病毒多克隆抗体可与对应型别的脊灰病毒的VP1、VP2、VP3发生特异性抗原抗体结合反应,相对分子质量分别在31 000~38 000、27 000~32 000和26 000~28 000之间;二免后,s IPV大鼠血清中和抗体阳转率及GMT均高于w IPV组;小鼠的急性毒性和豚鼠全身主动过敏反应均为阴性。结论制备的s IPV具有良好的免疫原性和安全性。     

sIPV疫苗D抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立牛多抗对兔多抗夹心ELISA方法 检测Sabin株脊灰病毒灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus Vaccine,sIPV)D抗原含量,并对建立的方法 进行验证。方法 分别采用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sIPV疫苗原液作为抗原制备兔多抗,并通过间接ELISA法检测其效价及特异性。以牛多抗为包被抗体、兔多抗为显示抗体建立检测D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法 ,并对方法 的准确度、精密度及D抗原专属性进行验证。用建立的方法 检测国内5家企业sIPV疫苗样品。结果 制备获得型别特异性好、效价高的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型兔多抗,并成功建立了双抗体夹心ELISA方法 。采用四参数拟合,3型别标准曲线均具有良好的线性关系,R²均>0.99。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各试验加标回收率均为80%～120%,各浓度平均回收率分别为98.11%、97.41%、98.66%;重复性与中间精密度CV均<10%;能够对D/C抗原进行区分。建立的方法 对5家企业生产的sIPV疫苗均能够进行D抗原定量检测。结论 成功建立了检测sIPV疫苗D抗原含量的双抗体夹心ELI...     

抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备

目的制备抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体,为ELISA检测方法的建立奠定基础。方法将Ⅰ型脊髓灰质炎减毒疫苗原液和灭活疫苗原液经超滤、超离纯化,以纯化的减毒脊髓灰质炎病毒D抗原免疫BALB/c小鼠,得到的脾细胞与SP2/0-A14小鼠骨髓瘤细胞融合,以纯化的灭活脊髓灰质炎病毒D抗原建立间接ELISA法,筛选分泌特异性单抗的阳性细胞株,诱生小鼠腹水,通过正辛酸-硫酸铵法纯化抗体,并进行各项鉴定。结果获得两株稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒单抗的细胞株7G5及5E4。纯化的7G5和5E4株单抗分别可与脊髓灰质炎病毒D抗原的VP2、VP3衣壳蛋白结合;在不同温度下放置均比较稳定;pH4不利于7G5株单抗的保存;5E4株单抗的相对亲和力大于7G5株;7G5株单抗的亚类为IgM,5E4株单抗的亚类为IgG2a;两株单抗可识别相似表位;7G5株和5E4株单抗的中和效价分别为1:64和1:128。结论已成功制备了两株分泌抗脊髓灰质炎病毒的单抗。     

一种离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ方法的建立及保护剂配方的筛选

目的建立一种离子交换层析结合病毒灭活方式获得人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的方法,并筛选其保护剂配方。方法采用聚乙二醇沉淀法及离子交换层析法对血浆来源的冷沉淀进行纯化,经S/D和80℃72 h干热两步病毒灭活法进行病毒灭活,验证灭活效果,并筛选最佳保护剂配方。结果聚乙二醇沉淀后的FⅧ纯度较新鲜血浆提高了约110倍,离子交换层析纯化后FⅧ纯度提高30倍以上;S/D和80℃72 h干热法的灭活效果良好。最佳保护剂配方为0.01 mol/L枸橼酸钠、0.001 mol/L氯化钙、8 mg/ml白蛋白和40 mg/ml盐酸精氨酸。结论该方法可制备纯度较高、稳定性和安全性较好的FⅧ制品,确定的保护剂配方对干热灭活的耐受性良好。     

荧光定量PCR方法在脊髓灰质炎病毒突变分析中的应用

目的建立检测脊髓灰质炎病毒突变比例的荧光定量PCR方法,并进行验证及初步应用。方法分别建立检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒突变株和非突变株的荧光定量PCR方法,并进行特异性、重复性和灵敏度验证。通过Ct值计算样品的突变比例(revertant proportion,RP),并进行准确性和重复性验证。采用建立的荧光定量PCR方法检测脊髓灰质炎病毒减毒株的突变比例。结果建立的检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒突变株和非突变株的荧光定量PCR方法能够特异性扩增相应基因片段;重复性试验Ct值的变异系数(CV)为0.085%~5.564%;灵敏度为1×10-7~1×10-6ng,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型非突变荧光定量PCR可分别检测到含量约0.084 3、0.029 2和0.266 7 CCID50的病毒。荧光定量PCR测定RP的方法经验证发现,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合质粒对照的RP检测值与理论值的差异较小,分别为0.040 9±0.037 4、0.008 8±0.034 3和-0.029 6±0.026 8。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎减毒株的RP分别为0.001 0、0.002 0和0.001 7。结论荧光定量PCR分析脊髓灰质炎病毒突变比例的方法,特异性、重复性及准确性均较好,并具有较高的灵敏度,可用于实验室内部对脊髓灰质炎病毒的突变比例测定,并可能成为脊髓灰质炎病毒体内或体外神经毒力评价的替代方法。     

3种培养方法培养脊髓灰质炎病毒过程中病毒繁殖特性比较

目的比较3种培养方法培养脊髓灰质炎病毒过程中病毒繁殖动力学特性。方法分别用悬浮吸附法、静止吸附法和非吸附法培养脊髓灰质炎病毒(SabinⅠ、Ⅱ、中Ⅲ2型),分别在间隔12h时取样,至细胞完全病变或96h,用微量细胞病变法检测感染性滴度,绘制病毒一步生长曲线。结果悬浮吸附法病毒增殖快,2∶1分种率时,60h细胞完全病变,滴度最高,分别为SabinⅠ型9.000LgCCID50/ml、SabinⅡ型8.500LgCCID50/ml、中Ⅲ2型8.750LgCCID50/ml;1∶1分种率时,SabinⅠ型在60h完全病变,滴度为8.875LgCCID50/ml,SabinⅡ型和中Ⅲ2型在70h完全病变,滴度分别为8.000LgCCID50/ml和8.125LgCCID50/ml;静止吸附法1与静止吸附法2差异不明显,96h时,仍有约10%~20%细胞未发生病变,静止吸附法1滴度为SabinⅠ型7.125LgCCID50/ml、SabinⅡ型6.500LgCCID50/ml、中Ⅲ2型6.375LgCCID50/ml,静止吸附法2滴度为SabinⅠ型7.250LgCCID50/ml、SabinⅡ型6.875LgCCID50/ml、中Ⅲ2型7.000LgCCID50/ml;非吸附培养法,在96h,有20%细胞未发生病变或病变程度较轻。滴度为SabinⅠ型7.250LgCCID50/ml、SabinⅡ型5.625LgCCID50/ml、中Ⅲ2型6.375LgCCID50/ml。在12h,悬浮吸附法(分种率2∶1)培养三型病毒滴度已分别达到6.000、6.125和6.250LgCCID50/ml,略高于悬浮吸附法(分种率1∶1)达到的值,而静止吸附法及非吸附法培养至36h,病毒滴度才达到相近的水平。结论在3种培养方法中,悬浮吸附法明显优于静止吸附法和非吸附法。