产GL-7ACA酰化酶基因工程菌的高活性表达

实现了戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)酰化酶的组成型表达,并通过替换重组质粒启动子的RBS序列,在摇瓶培养条件下,使新构建的重组质粒pGEMKT-HPRfACY在大肠杆菌JM105中表达GL-7ACA酰化酶酶活达到0.44 U/mL,是替换前的2倍. 使用廉价的玉米浆作为培养基中氮源主要来源,使JM105/pGEMKT-HPRfACY菌株酶活提高到2.98 U/mL. 采用补料批式培养,利用流加营养物控制发酵中后期的pH值,在pH为7.5的条件下,酶活峰值达到6.37 U/mL. 该体系无需诱导,工艺操作过程简单,成本低廉.     

内源性血管生成抑制因子Arresten基因原核表达条件的优化

目的 优化内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达条件。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,RT-PCR扩增Arresten基因,构建重组表达质粒pBV220-Arr,分别转化感受态E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3),诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物,筛选出最优表达菌种,并对其菌体培养温度和时间、诱导温度和时间及溶解氧量进行优化。结果重组表达质粒pBV220-Arr经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)4种菌中诱导2和4 h,均能表达出Arresten蛋白,诱导表达4 h,E.coli BL21(DE3)目的 蛋白表达量最高,湿菌重也明显大于其他菌种。E.coli BL21(DE3)/pBV220-Arr的最佳表达条件为:在500 ml培养瓶中加入100 ml LB氨苄阳性培养基,菌体于30℃培养4 h后,再42℃诱导表达4 h。结论优化了Arresten基因工程菌的表达条件,为重组Arresten蛋白的大量表达提供了参考。     

E.coli M15 (pQTPL)高效发酵生产酪氨酸酚裂解酶的控制策略

在摇瓶和4 L发酵罐上研究了营养和环境条件对重组菌E. coli M15 (pQTPL)分批发酵生产酪氨酸酚裂解酶(TPL)的影响. 在培养基中添加20 g/L葡萄糖和1.0 g/L玉米浆使TPL酶活提高到63.1 U/g(干重). 在此基础上,维持发酵液中溶氧水平为30%,可使菌体浓度在8 h达到4.78 g/L,酶活为54.6 U/g,比对照组(不控制溶氧)分别提高了21%和31.6%. 采用溶氧反馈调节-限制性补料策略,可使菌体浓度提高到31.5 g/L. 采用两阶段温度和pH控制策略,在发酵前8 h控制pH 7.0、温度37℃,8 h 至发酵结束之间控制pH为8.0、温度为30℃,可使重组菌的TPL酶活达到154.4 U/g,并使TPL在细胞中过量表达,实现了高菌体浓度和高TPL酶活的统一.     

产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化

目的克隆产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)全基因,在大肠埃希菌(E.coli)中表达并纯化α毒素。方法设计并合成CPA的全基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28aCPA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化表达条件,并对重组蛋白进行纯化。结果双酶切和测序鉴定结果表明,CPA基因以正确的阅读框架克隆入pET-28a载体中;表达的重组蛋白相对分子质量约为43 000,主要以可溶性形式表达,最佳培养基为TB培养基,最佳诱导温度为37℃,诱导时间为3 h;纯化的重组蛋白纯度达95%以上,浓度为0.663 mg/ml,收率为5 mg/g湿菌。结论成功在E.coli中表达了CPA,纯化后的CPA纯度较高,为进一步研究其结构、功能、致病机制及制备抗α毒素人源单链抗体奠定了基础。     

抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化

目的构建抗肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)单链抗体(Single chain fragment variable,scFv)的原核高效表达体系,并优化表达条件。方法在引物中添加编码6×His的核苷酸片段,使目的蛋白C-末端带有6×His标签。从质粒pCANTAB 5E-scFv中PCR扩增scFv基因,连接至pBV220载体,连接产物分别转化至E.coli BL21(DE3)和DH5α中,42℃诱导表达,并对诱导时间、培养基pH值和类型进行优化,Western blot分析表达产物的反应原性。结果 PCR扩增出的scFv基因片段长度约770 bp,且序列正确;重组表达质粒pBV220-scFv经酶切鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中可获得表达,在E.coli DH5α中不表达;表达的重组scFv相对分子质量约为28 000,以包涵体形式存在于胞浆中,表达量约占菌体总蛋白的15%,且可与抗His-Tag抗体发生特异性反应;工程菌的最佳诱导表达条件为:以E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在pH 7.4的LB培养基中,42℃诱导5 h。结论将scFv的表达载体更换为pBV220,可提高scFv的表达量,在优化表达条件下,scFv的表达水平进一步提高。     

登革病毒NS2B-NS3蛋白酶在大肠埃希菌中表达条件的优化及酶活性测定

目的 在大肠埃希菌(E.coli)中表达登革病毒(dengue virus,DENV)NS2B-NS3蛋白酶，对表达条件进行优化，并测定酶活性，为抗DENV药物先导化合物的筛选与发现奠定基础。方法 将密码子优化的NS2B-NS3基因连接到pET-28a载体中，构建重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3，转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导NS2BNS3蛋白酶表达。通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度，确定NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件。使用HisTrap^TM亲和层析柱分离纯化NS2B-NS3蛋白酶，通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)试验测定酶活性。结果 重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3经双酶切(NheⅠ/XhoⅠ)及测序证明构建正确。NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件为：诱导温度20℃，诱导时间10 h,IPTG浓度0.2 mmol/L，表达量达20 mg/L。纯化的NS2B-NS3...     

重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体p ET30a(+)连接构建表达质粒p ET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体p CDFDute-1连接构建表达质粒p CDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内。经异丙基-?-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 k D的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。     

一种肺炎链球菌重组蛋白PsaA-PspA23原核表达载体的构建及表达

目的优化肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23的同源区序列,阻止该基因的组氨酸标签(His-tag)融合表达,对突变后的目的基因进行表达及鉴定。方法以肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23为模板,设计2对具有重叠区的特异性引物,并分别对该重组基因进行扩增,得到Psa A-Psp A2和Psp A3的CDR区(亚类决定区)基因片段。利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术,将Psa A-Psp A2基因片段和Psp A3的CDR区基因片段连接,得到同源区优化后的基因片段。利用PCR技术扩增同源区优化后的基因片段,使该基因3′末端引入终止密码子,阻止Psa APsp A23基因表达载体上His-tag的融合表达。将得到的片段同源区优化且无His-tag融合表达的目的基因连接至p ET20b载体后,转入大肠埃希菌(E.coli)中进行表达,表达产物进行Western blot分析。结果重组表达质粒p ET20b-Psa A-Psp A23经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;转化E.coli中,37℃,IPTG终浓度1 mmol/L诱导5 h,获得可溶性表达的重组蛋白,且无His-tag。结论 Psa A-Psp A23蛋白基因同源区优化及His-tag成功去除,并在原核表达系统E.coli中可溶性表达,可为Psa A-Psp A23蛋白疫苗的进一步研究奠定基础。     

转氨酶ATA117基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的重组表达及产酶条件优化

采用基因工程的方法构建重组大肠杆菌得到重组菌Eco(p ETDuet-ATA117),实现了转氨酶ATA117的重组表达。使用响应面法对重组大肠杆菌摇瓶发酵产酶培养基进行了优化并对转氨酶诱导条件进行研究。首先采用二水平部分因子设计筛选确定培养基中对转氨酶ATA117酶活有显著影响的3种培养基组分,即甘油、酵母粉和胰蛋白胨。然后进行最陡爬坡实验确定最佳响应面区域,最后通过Box-Behnken设计确定各成分的最佳浓度。采用该优化培养基,转氨酶酶活为391.7 U/L,分别是基础培养基和单因素优化培养基酶活的3.13倍和1.22倍。对转氨酶的诱导条件进行了研究,得出最适诱导温度24℃,光密度值(OD)为0.8,此条件下进行诱导,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1 mmol/L,诱导时间15 h,最终转氨酶活力达到713.7 U/L。     

嗜热β-葡萄糖苷酶的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化嗜热β-葡萄糖苷酶,并检测其活性。方法从嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans基因组DNA中PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因,插入原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)Codon Plus,筛选阳性重组菌,IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组酶;紫外吸收法检测酶活力和底物选择性。结果 PCR退火温度为67℃时,可扩增得到单一的目的基因条带;测序结果显示,重组表达质粒中目的基因的核苷酸序列与细菌基因组中该基因序列同源性为100%,未发现终止密码子及氨基酸的改变;表达的重组酶相对分子质量约为54 000;纯化的目的蛋白纯度达95%,浓度为10 mg/L;该重组酶能够高效催化对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p NPG)的水解,60℃条件下的比活力达124 293.5 U/mg。结论成功在E.coli中表达了嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans来源的具有较高催化活力和底物专一性的β-葡萄糖苷酶。     

响应面分析优化霉酚酸发酵培养基

借助Design Expert 7.0软件,对霉酚酸发酵培养基的主要成分进行优化研究。首先采用全因子设计找出玉米浆和蔗糖为影响霉酚酸产量的主要因素,通过最陡爬坡法逼近最大响应区域,再利用中心组合设计及响应面分析法进行回归分析,求得两因素的最优水平：玉米浆98 g/L,蔗糖53 g/L。经验证,发酵培养基优化后菌株产量提高了38.2%。     

响应面优化木糖母液发酵产丁二酸

对产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）GXAS137发酵木糖母液产丁二酸的条件进行优化,探索利用废弃木糖母液合成高附加值丁二酸的可行性。首先通过Plackett-Burman实验设计确定影响丁二酸发酵的显著因子,然后采用最陡爬坡实验逼近各显著因子的最优区域,最后通过Box-Behnken实验设计确定各因子的最优水平。影响木糖母液发酵产丁二酸的显著因子及最优浓度分别为：木糖母液64.75g/L,玉米浆15.71g/L,碱式碳酸镁46.39g/L。在最优发酵培养条件下,丁二酸产量达到38.01g/L,比优化前提高了20.7%,与模型预测值（38.41g/L）基本一致。进一步利用2L发酵罐进行了放大试验,发酵72h丁二酸产量最高可达48.99g/L,较厌氧瓶发酵提高了28.9%,丁二酸得率为0.80g/g总糖。结果表明,采用低价的木糖母液作为底物,可为未来低成本、高效产业化生产丁二酸奠定坚实的基础。     

实验设计法优化核酸酶P1的发酵培养基

采用实验设计法研究了碳源、氮源和磷源等因素对桔青霉(Penicillium citrinum)M02发酵产核酸酶P1的影响. 实验结果表明，含有玉米浆的复合氮源可以明显地提高核酸酶P1的产量. 同时通过两轮实验建立了一个可以较好预测实际发酵的二次模型，并依据此模型优化了碳源、氮源以及磷源的组成，优化后的产核酸酶P1的发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖38.73，蛋白胨1.91，玉米浆1.84, KH2PO4 0.6, K2HPO4×3H2O 0.6, MgSO4 0.4, CaCl2 0.4, ZnSO4×7H2O 0.4. 用此培养基进行发酵，实际产酶水平为648.3 U/ml，与优化前的380 U/ml相比提高了约70%. 此外，还初步探讨了玉米浆促进P1酶发酵的机理，这是因为玉米浆与蛋白胨相比含有了较多有利于P1酶发酵的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸以及丝氨酸等.     

维生素C二步发酵培养基优化

采用正交实验法对维生素C二步发酵培养基进行了优化,获得的优化配方为玉米浆1%、尿素0.2%、硫酸镁0.02%、磷酸二氢钾0.4%。并且使用10 L发酵罐对发酵配方进行了验证。     

安丝菌素P-3生产菌株Actinosynnema pretiosum ssp. auranticum的诱变育种及其发酵培养基优化

为了提高安丝菌素P-3（AP-3）的发酵产量,通过紫外诱变并运用紫外-分光光度法建立96孔板高通量快速筛选体系对原始菌株（Actinosynnema pretiosum ssp.auranticum）进行育种,筛选获得了一株产量较高的突变菌株B24-13。发酵7天后,其发酵液中AP-3的含量为112.5mg/L,是原始菌株的2.03倍。随后通过单因素优化与正交实验设计对突变菌株B24-13进行发酵培养基优化,得到最优发酵培养基组分：蔗糖25g/L,甘油15g/L,玉米浆25g/L,CaCO₃ 7g/L,异丁醇2g/L,缬氨酸0.5g/L,MgSO₄·7H₂O 0.5g/L,FeSO₄·7H₂O 0.01g/L。对优化结果进行验证实验,发酵7天后AP-3的产量为（127.5±6.3） mg/L。实验结果表明：通过对生产菌株的诱变育种与发酵培养基优化可有效的提高AP-3的发酵产量,也从侧面验证了该研究所建立的96孔板高通量快速筛选体系用于AP-3高产菌株的初筛是可行的。     

辅酶Q10高产菌Rhizobium radiobacter的选育及发酵条件优化

以放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)WSH2601为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍复合诱变,获得遗传稳定性好的抗放线菌素D突变株WSH-F06. 在摇瓶中考察了碳、氮源等营养条件以及接种量、装液量和初始pH等环境条件对突变株WSH-F06细胞生长和积累辅酶Q10的影响. 通过诱变和优化发酵条件,突变株WSH-F06的辅酶Q10产量和胞内含量分别达到34 mg/L和2.4 mg/g,比出发菌株在同样条件下提高了16%.     

玉米浆干粉在葡萄糖和木糖混合丙酮丁醇发酵中的应用

为降低丙酮丁醇梭菌发酵生产丁醇的成本,研究了以玉米浆干粉为氮、磷源等营养因子的单糖培养基发酵条件。结果表明：只需添加适量的玉米浆干粉,无需添加其它营养物质,以葡萄糖或葡萄糖与木糖混合糖为原料的培养基可以满足丙酮丁醇梭菌的生长及溶剂产生所需要的营养元素,50 g/L葡萄糖-2.5 g/L玉米浆干粉培养基溶剂转化率可以达到35.14%,总溶剂产量17.57 g/L,丁醇产量11.21 g/L。30 g/L葡萄糖+20 g/L木糖-2.5 g/L玉米浆干粉溶剂转化率可以达到33.66%,总溶剂16.83 g/L,丁醇11.10 g/L,为进一步研究木质纤维素原料水解液生产丁醇提供理论指导。     

Effects of three main sugars in cane molasses on the production of butyric acid with <Emphasis Type="Italic">Clostridium tyrobutyricum</Emphasis>

The effects of three main sugars in cane molasses were investigated systematically to prepare a cost-effective medium for butyric acid bioproduction. Additionally, 30 g/L corn steep liquor was screened out as the suitable nitrogen source. In the batch fermentation of free cells, when 60 g/L glucose was the only carbon source, 21.28 g/L butyric acid was achieved after 30 h cultivation. Similar product concentration, productivity and yield were obtained when 60 g/L fructose was applied. The utilization of sucrose would bring about lower productivity (0.29 g/L·h) and product concentration (18.15 g/L), but the yield of butyric acid/sucrose (0.34 g/g) is almost the same as that from glucose or fructose (0.35 g/g). Finally, the sugar mixture (15 g/L glucose, 20 g/L fructose and 35 g/L sucrose) was employed to produce butyric acid in a fibrous-bed bioreactor (FBB), and 40.11 g/L butyric acid was produced with one simple fed-batch strategy.     

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。     

丙酸高产菌株的选育及发酵培养基优化

通过环境压力筛选获得了一株耐受30 g/L丙酸的产酸丙酸杆菌菌株(Propionibacterium acidipropionici WY320),降低了发酵过程中丙酸的反馈抑制作用,采用正交实验设计优化了发酵培养基. 结果表明,发酵培养基最适的玉米浆、酵母膏和(NH4)2SO4浓度分别为60, 10和7.5 g/L. 该条件下,摇瓶培养耐酸菌株的发酵周期为240 h,丙酸产量为49.35 g/L,较优化前提高72.98%,产率为0.21 g/(L×h); 5 L发酵罐培养的发酵周期为168 h,丙酸产量达51.96 g/L,产率为0.31 g/(L×h),较摇瓶培养提高47.62%,优于文献报道水平.