质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较

目的对检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA含量的Southern blot和Real-time PCR法进行比较。方法PCR扩增宿主菌染色体DNA的16SrRNA片段,以地高辛标记回收的目的片段为探针,对提取的质粒pcDNAH进行Southern blot,同时根据16SrRNA基因序列设计探针,建立Real-time PCR反应体系和标准曲线,分别检测质粒中宿主菌基因组DNA的含量。结果应用Southern blot和Real-time PCR检测质粒pcDNAH中宿主菌基因组DNA的含量,结果均符合WHO相关标准。结论两种检测方法各有优缺点,均可用于检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA的残留,可根据不同情况,采用不同方法或配套使用。     

单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化单增李斯特菌溶血素O(Listeriolysin O,LLO)。方法 PCR扩增LLO hly基因,并插入pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-hly,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,切胶纯化重组蛋白,并进行Westernblot分析。结果克隆的hly基因长1 515 bp,与GenBank中登录的hly基因的核苷酸序列同源性为99%;重组表达质粒pET-hly经酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,表达量占细菌总蛋白的45.2%;纯化的重组蛋白可与单增李斯特菌阳性血清反应。结论已成功原核表达并纯化了LLO,为下一步诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

嘧菌酯农药标准物质的研制

为了研制嘧菌酯农药标准物质,用重结晶方法对嘧菌酯原药进行纯化,得到的纯品用四大谱进行结构鉴定,并进行了均匀性检验和稳定性检验,最后以8家实验室合作定值方式确定量值。研制的嘧菌酯农药标准物质量值为99.2%,扩展不确定度为0.6%。用归一化法验证该量值准确。     

肟菌酯和啶氧菌酯农药标准物质的研制

利用制备液相色谱对肟菌酯原药和啶氧菌酯制剂进行纯化,得到的标准物质采用超高效液相色谱仪(UPLC-PDA)和质谱(MS)结合标准品对照的方式进行定性分析,并进行了均匀性检验和稳定性检验,最终以8家实验室合作定值的方式确定所制标准物质的量值。     

大质粒DNA提纯方法的改进

本文报道了一种源于Kado-Liu法经系列改进后产生的大质粒DNA检测与提取方法。改进之处主要是:裂解液组成中的Tris度为500mM,pH值为12.8～13.0;蛋白质的抽提除了酚—氯仿外同时使用了适量的醋酸钠(3M pH4.8)溶液;以异丙醇室温静置30分钟左右,取代冷乙醇较长时间的低温处理,进行DNA浓缩。该方法在肠道菌方面的应用中,显示了其简易、快速和较好的重复性。另外,用930～950μl新鲜10N NaOH液使裂解液pH值为最佳的经验值,既可避免因不同类型pH计产生不同结果的麻烦,亦为该方法能在普通实验室推广应用提供了方便。     

汞单元素标准物质的比较研究

运用比较研究方法,将Q/HS HX 1.07.3056中测定天然气中硫化氢汞量法所使用的汞标准溶液,由原来的氧化汞配制法改成用汞单元标准物质(GBW08617)配制法,达到了省时省力。节约费用的目的。改进配制方法,标准溶液的有效期较改进前有所提高,可满足工业大量生产分析检测的需要。     

治疗用质粒DNA的纯化工艺

目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。     

小鼠神经生长因子基因治疗型DNA质粒的质量控制

目的对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制。方法用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用上述方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所采用的质控方法和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控。     

发酵培养中葡萄糖对超螺旋质粒DNA产量的影响

本文首先研究了含有不同质量浓度葡萄糖的发酵培养基对超螺旋质粒DNA产量的影响。结果表明,发酵培养基中最佳葡萄糖的质量浓度为2 00g L。此培养基与未添加葡萄糖的培养基相比,超螺旋质粒DNA产量提高2 56倍;菌体密度提高1 26倍。其次研究了优化培养基下影响超螺旋质粒DNA产量的各参数变化规律。     

GFAAS法测定标准物质茶叶中铅不确定度分析

采用石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)测定标准物质绿茶GBW10052(GSB-30)中的铅。建立了茶叶中铅不确定度的数学模型,分析了测量过程中的不确定度主要来源。通过对各个不确定度的计算合成得出被测量样品中铅含量的扩展不确定度和相对不确定度。当置信概率95%,且取扩展因子k=2时,茶叶中铅扩展不确定度为0.013 4 mg/kg。     

TD-GC/MS法研究气、液相标准物质对环境空气中苯系物含量测定的差异影响

使用热脱附-气相色谱/质谱法(TD-GC/MS),探究了气、液相标准物质对气体样品中苯系物测定的差异影响.分别绘制了7种苯系物气、液相标准物质的校准曲线,发现液相标物中各苯系物的响应明显高于气相标物.通过一系列猜想的提出及穿透实验、二次解析、甲醇试验等的试验验证,认为甲醇大量电离形成的高能量氛围,提高了苯系物的电离能力...     

CTAB法制备超螺旋质粒DNA

研究了基因治疗用载体质粒DNA的一种非色谱的大规模纯化方法-CTAB沉淀法,并对其进行了工艺优化. 首先采用高纯过滤介质CelPure去除大量杂质,并利用CTAB浓度梯度溶液研究了不同形式DNA(超螺旋质粒DNA、切口质粒DNA、线性质粒DNA、染色体DNA)沉淀能力的差异,选择性地从蛋白质、RNA及其他形式DNA中提取超螺旋质粒DNA. 针对含有pcDNA3的DH5a菌株,确定CTAB完全沉淀超螺旋质粒DNA的浓度为2.0 g/L,由NaCl对不同沉淀的溶解能力,确定溶解沉淀的最优盐浓度为0.75 mol/L. 用此方法得到的超螺旋质粒DNA的纯度达90%以上,收率为78.94%. RNA、蛋白质残量以及内毒素均符合药品质量标准要求. CTAB对质粒DNA的沉淀效果与质粒DNA的初始浓度有关,并且超螺旋质粒DNA浓度的降低与CTAB的添加量呈一定的线性关系. 超螺旋质粒的分子量越小越不易被分离,并且结构特性比分子量在分离过程中更据主导作用.     

多菌灵农药标准物质的研制

[目的]研制多菌灵农药标准物质。[方法]用重结晶方法对多菌灵原药进行纯化,得到的纯品用UV、I R、N M R、M S进行结构鉴定,并进行了均匀性检验和稳定性检验,最后以8家实验室合作定值方式确定量值。[结果]研制的多菌灵农药标准物质量值为99.0%,扩展不确定度为0.6%。[结论]用归一化法验证该量值准确。     

Certification of a Diesel Particulate Related Standard Reference Material (SRM 1975) for PAHs

Standard Reference Materials (SRMs) are Certified Reference Materials issued by the National Institute of Standards and Technology (NIST). Three of these materials, SRMs 1975 (Diesel Particulate Extract), 2975 (Diesel Particulate Matter, Industrial Forklift), and 1650 (Diesel Particulate Matter) are diesel particulate-related materials that are well characterized for PAH isomer distributions. SRM 1975 is a methylene chloride extract of industrial forklift diesel particulate matter and it was developed originally in response to the needs of the bioassay community for a natural environmental extract. Thirty-nine PAHs (or combinations of PAHs) were determined in SRM 1975 using various combinations of four different methods of analysis. SRM 1975 will be issued with certified concentrations for eight PAHs. In addition, reference concentrations will be provided for additional PAHs, including many alkyl substituted isomers such as methylphenanthrenes, methylpyrenes, and methylfluoranthenes. Reference values for the mutagenic activity of the extract will also be provided. The approach and results for the certification of PAH concentrations in SRM 1975 are described in this paper.     

Evaluation of Optimization Metrics for Continuous Fermentation of Plasmid DNA

An evaluation of cumulative productivity metrics for optimizing the continuous fermentation of plasmid DNA (pDNA) is carried out in this work. DNA plasmids provide a good illustrative example for comparison because of the plasmid instability issues associated with their production. However, the analysis presented in this work can also be applied to other intracellular bioproduct continuous fermentation systems. The productivity metrics considered are cumulative product mass per time, profit, and cost objective functions. These metrics are used to determine the optimal continuous fermentation run time at a given dilution rate, during the dynamic period associated with switching from batch to continuous fermentation. The results of this study indicate that different optimum continuous fermentation run times are predicted based upon the choice of the continuous fermentation operating conditions and optimization metric. In particular, the dilution rate must be larger than the inverse of a characteristic time, that is a function of the initial batch operating and plasmid stability times before continuous operation becomes optimal. Provided that this condition is met, different optimal continuous operation run times are obtained depending on the cumulative productivity metric, or operating objective, that is employed.     

羟苯乙酯纯度标准物质的研制

通过定性分析、定量分析、均匀性检验、稳定性检验和不确定度评定,研制了标题化合物。采用紫外、红外、核磁和质谱对羟苯乙酯进行定性分析。采用高效液相色谱法(HPLC-UV)和气相色谱法(GC-FID)进行主成分定值。利用卡尔费休法、灼烧法、气相色谱法对杂质进行分析。研制的标题化合物均匀性良好,纯度值定为99.80%,扩展不确定度为0.22%(k=2)。     

氯气气体标准物质的研制

本文介绍了国内氯气气体标准物质的发展水平以及对氯气标准物质的需求,根据实验室的要求提出了对氯气气体标准物质的研究目标和内容。采用称量法准确制备及定值,并通过仪器分析手段进行标定,实验数据分析表明所研制的氯气气体标准物质达到了阶段性研究成果。