牛乳铁蛋白十肽的基因改造、克隆及表达

目的克隆并表达牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因。方法参照大肠杆菌偏爱密码子,分别针对牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,设计并合成两个具有相同黏性末端的DNA片段,同时在其基因前后分别加上天冬酰胺和甘氨酸的密码子,构成羟胺裂解位点,通过连接获得其二拷贝基因同向串联体。分别将该串联体克隆至载体pUC18上,经双酶切、PCR及测序鉴定后,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物纯化后,用凝血酶切割及羟胺裂解。结果获得了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2二拷贝基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出相对分子质量约29000的目的蛋白条带,纯化后的蛋白经凝血酶切割后,相对分子质量约29000的目的蛋白条带消失。结论已成功克隆并表达了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,为基因工程抗真菌肽的制备奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定

目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定。结果PCR扩增约770bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31000,纯化后鉴定为SEA蛋白。结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础。     

谷氨酰胺转胺酶基因的融合表达

运用基因工程手段在大肠杆菌中高效表达谷氨酰胺转胺酶基因。以茂原链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到一条长为1224bp的谷氨酰胺转胺酶基因片段,成功构建原核表达载体pGEX-TGase,并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经IPTG诱导产生GST-TGase融合蛋白,并对表达条件进行了优化,应用亲和层析方法纯化融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示目的蛋白获得了较高水平的表达。     

猪γ干扰素基因的合成、表达及纯化

目的通过人工合成猪γ干扰素(poIFN-γ)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,利用PCR合成poIFN-的成熟蛋白编码基因,克隆入pGEM-7Zf(+)载体,转化大肠杆菌TG1。经测序证实后,构建原核表达载体pBV222/poIFN-γ并转化大肠杆菌DH5α,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析及纯化。结果酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量约16500的位置出现明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的55%,占包涵体中总蛋白的80%,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,纯度达90%以上。结论已获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪γ干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

人BimS蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人BimS基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人BimS基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到327bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-BimS经双酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约37000,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度可达93%。结论已成功克隆并原核表达了人BimS基因,得到纯度较高的BimS蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。     

绵羊骨髓细胞抗菌肽基因的改造及其在原核生物中的表达

目的通过对绵羊骨髓细胞抗菌肽(sheep myeloid antibacterial peptides with 29 amino acids,SMAP-29)的活性片段SMAP-29(1-18)基因的改造,使其以C-端融合蛋白的形式在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中表达。方法根据大肠埃希菌偏爱密码子表,将SMAP-29的活性片段SMAP-29(1-18)基因序列进行改造,应用ProtParam分析SMAP-29的理化特性,Anthorprot软件预测其螺旋轮结构,设计新的基因片段,插入质粒pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30aSMAP-29[1-18,K2,4,L13],转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物过2次Ni2+NTA His Bind resin柱进行纯化。结果 SMAP-29基因序列经改造后,稳定性、等电点及半衰期均明显提高。重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约61 257,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的41%,纯度为81%。结论已成功对SMAP-29基因进行改造,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的高表达,获得了纯度较高的目的蛋白,为进一步规模化生产SMAP-29奠定了理论及实践基础。     

促凋亡蛋白BID多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗BID的多克隆抗体,用于检测凋亡信号转导过程中BID蛋白的表达。方法采用PCR技术合成编码BID特异性肽段的基因,构建GST融合基因表达载体,在E.coli BL21中诱导表达GST-BID多肽的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔,免疫血清经纯化后,得到抗BID的多克隆抗体,经Western blot鉴定其特异性。结果通过PCR扩增获得了BID肽段的编码基因;pGEX-6P-1-BID多肽重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;在E.coli BL21中表达了GST-BID多肽融合蛋白;纯化后蛋白纯度达95%;制备的抗BID多克隆抗体能够特异地识别BID蛋白。结论所制备的抗BID多克隆抗体可特异性检测BID蛋白。     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

分散液液微萃取用于苦瓜HPLC指纹图谱的研究

采用超声辅助提取苦瓜中的活性成分,利用分散液液微萃取（DLLME）技术对提取液进行浓缩,设计正交试验优化DLLME条件。在优化条件下,对不同产地苦瓜的超声提取液进行微萃取,萃取液进行HPLC分析,确定6个共有峰作为苦瓜的指纹峰,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版评价指纹谱图,不同产地苦瓜的HPLC指纹谱图与对照谱图（长沙苦瓜）之间的相似度均大于0.960。本研究为天然产物的鉴定和质量控制提供了一个新的途径。     

不同苦瓜多糖的体外抗氧化活性研究

从总还原能力、体外清除羟自由基能力、体外清除超氧阴离子自由基能力、体外清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH.)能力、对Fe2+诱发的脂质过氧化反应的抑制作用这五个方面对6种苦瓜多糖(即:苦瓜粗多糖、0.1mol/L NaC l溶液洗脱苦瓜多糖、0.3 mol/L NaC l溶液洗脱苦瓜多糖、硫酸化的苦瓜多糖)的体外抗氧化活性。结果表明,6种苦瓜多糖均有一定的抗氧化活性,并随着浓度的增加,抗氧化活性增强。其中苦瓜粗多糖MCP的总还原能力、对1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH.)的清除作用、Fe2+诱发的脂质过氧化反应的抑制作用强于其它五种苦瓜多糖。硫酸化后的苦瓜多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除作用较硫酸化前有所提高,并呈量效关系。试验结果表明,苦瓜粗多糖、经分离纯化得到的组分、硫酸化苦瓜多糖均有抗氧化活性。     

苦瓜多糖研究综述

苦瓜是一种药食同源瓜果,其含有的苦瓜多糖具有清热解毒、降血糖,提高免疫力等生理功能,是一种理想的保健产品,文章就苦瓜多糖的提取工艺、测定方法以及应用做一综述。     

Introgression Between Cultivars and Wild Populations of Momordica charantia L. (Cucurbitaceae) in Taiwan

The landrace strains of Momordica charantia are widely cultivated vegetables throughout the tropics and subtropics, but not in Taiwan, a continental island in Southeast Asia, until a few hundred years ago. In contrast, the related wild populations with smaller fruit sizes are native to Taiwan. Because of the introduction of cultivars for agricultural purposes, these two accessions currently exhibit a sympatric or parapatric distribution in Taiwan. In this study, the cultivars and wild samples from Taiwan, India, and Korea were collected for testing of their hybridization and evolutionary patterns. The cpDNA marker showed a clear distinction between accessions of cultivars and wild populations of Taiwan and a long divergence time. In contrast, an analysis of eight selectively neutral nuclear microsatellite loci did not reveal a difference between the genetic structures of these two accessions. A relatively short divergence time and frequent but asymmetric gene flows were estimated based on the isolation-with-migration model. Historical and current introgression from cultivars to wild populations of Taiwan was also inferred using MIGRATE-n and BayesAss analyses. Our results showed that these two accessions shared abundant common ancestral polymorphisms, and the timing of the divergence and colonization of the Taiwanese wild populations is consistent with the geohistory of the Taiwan Strait land bridge of the Last Glacial Maximum (LGM). Long-term and recurrent introgression between accessions indicated the asymmetric capacity to receive foreign genes from other accessions. The modern introduction of cultivars of M. charantia during the colonization of Taiwan by the Han Chinese ethnic group enhanced the rate of gene replacement in the native populations and resulted in the loss of native genes.     

苦瓜多肽的分离纯化研究

以苦瓜为原料分离纯化制备多肽,通过正交试验确定了酶解的最佳工艺条件:加酶量为4%,温度45 ℃,酶解时间为1 h,料液比为2,多肽得率提高19.7%.采用葡聚糖凝胶G-50纯化得到2组洗脱液.此分离纯化工艺简单可行,成本低,可适用于工业化生产.     

裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体的构建及大肠杆菌菌影的制备

目的构建噬菌体裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体,制备高质量的大肠杆菌菌影。方法自行设计一对引物,PCR扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,将该基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建大肠杆菌菌影的表达载体pGEX-E。在E基因基础上与辅助基因葡萄球菌核酸酶A(SN)基因串联,并插入pGEX-6P-1载体,构建双基因串联高效表达载体pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,制备大肠杆菌菌影。结果裂解基因E单基因及串联基因已成功插入融合表达载体pGEX-6P-1,所构建的大肠杆菌菌影表达载体pGEX-E、pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,诱导后经透射电镜及活菌计数显示大肠杆菌已发生不同程度裂解,制成了大肠杆菌菌影。电镜下菌影形态完整,内容物已释放到胞外。结论已成功构建了噬菌体裂解基因E单基因及裂解基因和核酸酶基因串联基因表达载体,并制成了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗及佐剂形式奠定了基础。     

pET28a-Chaperonin 10重组载体的构建及SARS-CoV蛋白高效表达

目的建立在大肠杆菌中高效表达SARS-CoV蛋白的表达系统。方法PCR扩增BCG分子伴侣10基因,并将其连接到pET28a载体上,构建成分子伴侣10融合蛋白表达载体。在该载体Chaperonin10基因的3′端克隆SARS-N、SARS-E、SARS-S和SARS-M基因,在BL21(DE3)中进行诱导表达。结果SARS-E、SARS-N在与分子伴侣10融合后能获得高效表达。结论该表达系统可使部分在大肠杆菌中难于表达的SARS-CoV蛋白获得高表达。     

蜂毒肽/变构hIL-2融合蛋白的原核表达及其对宿主菌生长的影响

目的构建蜂毒肽(Melittin)与变构hIL-2融合基因原核表达质粒,并检测表达的融合蛋白对宿主菌E.coli生长的影响。方法以质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,通过PCR定点诱变为Melittin-IL-2(88Arg,125Ala),将PCR产物和pET-15b载体分别经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE及ELISA分析表达产物;检测诱导不同时间重组菌的A600值,绘制生长曲线,并进行活菌计数。结果PCR扩增的目的片段长542bp,重组表达质粒测序分析证明目的基因如预期突变;ELISA可检测到目的蛋白表达,但表达量较低;SDS-PAGE分析未见目的条带;诱导表达4h,重组菌A600值由0.8下降至0.6;诱导2h,活菌计数由108个/ml降至104个/ml。结论已成功构建了原核表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),表达的融合蛋白可能对宿主菌具有毒性,从而杀伤宿主菌。     

基于转录机器全局扰动筛查迟钝爱德华菌毒力相关基因

目的通过转录机器(RNA聚合酶)σE因子过量表达实现全局转录扰动,筛查迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda,E.tarda)毒力相关基因。方法从E.tarda EIB202中PCR扩增RNA聚合酶σE因子编码基因rpoE,连接到载体pACYC184上,构建rpoE基因过量表达菌株;在克隆rpoE基因时引入突变,使该基因表达失活,构建移码突变失活菌株。感染模式生物斑马鱼,检测各菌株半数致死剂量(LD50),RT-PCR法检测各菌株rpoE及其下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO mRNA的转录水平。结果重组质粒pACYC184-rpoE经双酶切及测序证实构建正确;在102、103、104和105CFU/g注射浓度下,空载体转染菌株和rpoE基因过量表达菌株的毒力差异无统计学意义(P>0.05);与空载体转染菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因mRNA的转录水平上调9.5倍;与rpoE基因移码突变失活菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO分别上调6.9、2.64、2.85、2.38、1.34倍。结论成功构建了E.tarda rpoE基因过量表达菌株以及移码突变失活菌株,初步确定degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO 5个基因与E.tarda毒力相关。     

微波提取苦瓜总黄酮的工艺研究

以苦瓜果实为原料,以总黄酮提取率为评价指标,通过单因素实验考察了微波功率、液固比、乙醇体积分数、苦瓜粉末粒度等对总黄酮提取率的影响;在此基础上,通过正交实验确定最佳提取工艺条件为：微波功率500 W、液固比11∶1（mL ∶ g）、乙醇体积分数60％、苦瓜粉末粒度80目,在此条件下总黄酮提取率为15.576 mg·g-1.