HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

对构建HPV16 E6基因的原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6进行研究.从宫颈癌细胞株CaSki细胞中提取的的DNA基因组为模板,设计一对特异性引物,用PCR法扩增出HPV16E6基因片段.HPV16E6基因片段和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后用T4 DNA连接酶连接.构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21 Star-DE3 Plyss中,构建了HPV16 E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6.HPV16E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6的构建为HPV16 E6重组蛋白的制备和为宫颈组织HPV16型感染的早期诊断和相关治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

HPV16 L1基因的PCR扩增、纯化和酶切鉴定

用重组DNA技术获取人乳头瘤病毒(HPV)16型晚期基因L1.以提取的宫颈癌细胞株Caski细胞总DNA为模板,设计一对L1基因特异引物,用PCR方法扩增HPV16 L1重组基因,用柱层析技术纯化和酶切初步鉴定HPV16 L1重组基因.该方法不仅可以扩增出HPV16 L1重组基因,用层析技术纯化HPV16 L1重组基因,还能通过酶切鉴定PCR产物HPV16 L1全长基因,为HPV感染的检测诊断和宫颈癌疫苗的制备奠定基础.     

HPV16 E6基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达HPV16 E6重组蛋白.利用自行构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6,经IPTG诱导表达HPV16 E6重组蛋白.实验结果表明,重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6在大肠杆菌中经IPTG诱导成功表达出HPV16 E6重组蛋白.HPV16E6重组蛋白的制备为宫颈组织中HPV16型感染的早期诊断和宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

双基因溶瘤腺病毒O~(Ad)-mK5-shPKM2抗肝癌活性的初步探究

研究携带mK5和shPKM2的双基因溶瘤腺病毒(OAd-mK5-shPKM2)对肝癌细胞的体内和体外杀伤作用,通过PCR技术证明OAd-mK5-shPKM2中无野毒污染,Western blot检测腺病毒早期基因E1A和抗癌基因的表达,CCK8细胞增殖实验和动物实验检测溶瘤腺病毒对肝癌细胞的体外和体内杀伤作用。结果表明:OAd-mK5-shPKM2在细胞实验和动物实验中均可有效地抑制肝癌细胞的增殖,并且OAd-mK5-shPKM2对肝癌细胞增殖的抑制效果要强于单基因溶瘤腺病毒OAd-mK5或OAd-shPKM2。双基因溶瘤腺病毒OAd-mK5-shPKM2携带的两个基因可以共同促进溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用,为进一步研究恶性肿瘤的生物治疗提供理论依据。     

Survivin启动子介导的溶瘤腺病毒载体抗肿瘤研究

肿瘤特异性启动子用于调控溶瘤腺病毒载体靶向于肿瘤细胞,从而实现对肿瘤组织的特异性杀伤,肿瘤特异性启动子的应用已成为靶向基因病毒治疗中的一个重要策略.利用肿瘤靶向人源Survivin 启动子构建的重组腺病毒Ad.SP-E1A展开对多种肿瘤细胞和正常细胞杀伤实验研究,结果发现:Ad.SP-E1A具有较高的肿瘤靶向杀伤能力以及对正常细胞无毒副作用,为基因病毒治疗平台中选择高效安全的腺病毒载体提供参考.     

GSK-3抑制剂增强携带TRAIL的溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

研究携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒联合化疗药物GSK-3抑制剂(氯化锂和SB-415286)对人肝癌细胞的体外杀伤作用.采用MTT法检测病毒ZD55-TRAIL联合化疗药物氯化锂和SB-415286对肝癌细胞株HepG-2、BEL-7404以及正常细胞株L02、QSG-7701增殖的抑制作用,并通过结晶紫实验检测进一步证明联合用药的杀伤作用和安全性;利用Hoechst33342染色对肝癌细胞株BEL-7404的细胞凋亡进行形态学观察;通过Western blot检测肝癌细胞HepG-2细胞凋亡信号通路的变化.结果表明:低剂量的氯化锂和SB-415286能显著提高ZD55-TRAIL对肝癌细胞株HepG-2、BEL-7404的杀伤作用,对人体肝正常细胞株L02、QSG-7701无明显的抑制作用.说明GSK-3抑制剂能够解除肝癌细胞对TRAIL的抗性,增强携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤.     

灰树花菌丝体糖肽GFPS1b体内抗肿瘤作用的研究

采用移植型小鼠黑色素瘤B16模型进行试验，研究灰树花菌丝体糖肽GFPS1b的体内抗肿瘤作用。结果表明，灰树花菌丝体糖肽GFPS1b对移植型小鼠黑色素瘤B16有显著的抑制作用，抑瘤率在30％以上；样品作用组瘤体积生长速率比阴性对照组慢，且瘤体积小；同时能延长荷瘤小鼠的存活期；HE染色结果表明，GFPS1b中、高剂量组能使B16肿瘤细胞呈团索状实性排列或弥漫性分布，并有肿瘤细胞大片坏死，坏死区周围可见凋亡细胞；免疫组化技术进一步显示，GFPS1b能诱导瘤组织中Bax基因蛋白表达，同时也能显著下调Bcl-2蛋白的表达。研究表明，GFPS1b对小鼠移植性肿瘤有显著的抑瘤作用。     

携带11R穿膜肽-p53融合蛋白基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用

p53是研究较为广泛的抑癌基因,可通过不同的途径来抑制或杀伤肿瘤细胞.为增强p53的抗瘤活性,将穿膜肽11R与p53的融合蛋白基因插入增殖型腺病毒载体中,在293细胞中经同源重组筛选获得重组溶瘤病毒SG7605-11R-p53;利用Western blot检测11R-p53的表达情况,TCID50方法测定病毒滴度;应用细胞活力检测实验(MTT)比较病毒杀伤肿瘤及正常细胞的效果.结果显示:SG7605-11R-p53所携带的11R-p53基因在所选细胞株中都能正确表达,与SG7605-p53、AD5-p53相比具有更好的杀伤肿瘤细胞的效果,显示了较强的抗肿瘤效应.说明SG7605-11R-p53是一种有潜力的治疗肿瘤的新型基因-病毒治疗系统.     

新型结肠癌个性化治疗重组溶瘤腺病毒Ad—CEA-ZD55-ST13的构建

一种新型的重组溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13被成功构建.该病毒利用CEA(carcinoembryonic antigen)启动子和ST13基因特异性增强ZD55系统的肿瘤靶向性.实验表明,重组溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13能在结肠癌细胞株SW620中增殖;Ad-CEA-ZD55-ST13增加ST13基因在HCT116细胞中的表达量;Ad-CEA-ZD55-ST13比对照病毒Ad-CEA-ZD55-EGFP对HCT116的杀伤作用强.     

马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达

以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)天然膜蛋白基因(gp120)为基础设计的DNA疫苗在马体内的表达量很低,这与密码子使用偏嗜性、RNA剪切位点多和导致RNA不稳定性的腺苷丰富区的大量存在有关.为解决这些问题,合成了EIAV gp120基因(Syn-env),使其密码子偏嗜性符合高水平表达的哺乳动物基因.EIAV弱毒疫苗的制备过程中,出现了几个重要而稳定的N-糖基突变住点,以Syn-env为基础,运用重叠延伸PCR定点突变策略获得了6个具有不同N-糖基缺失组合的gp120基因.将突变后的基因克隆到真核表达载体pVRCSV1.0,然后转染Hela细胞,发现这些重组质粒均获得了表达.进而为比较6种质粒诱导机体免疫保护效果,阐明EIAV弱毒疫苗减毒机理奠定了基础.     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

TC-1型导热系数测定仪的改进

给出了TC - 1型导热系数测定仪的实验装置及其工作原理 ,提出了改进TC - 1型导热系数测定仪的新方法 ,论证了该方法的可行性和正确性 并对结果进行了讨论     

CDld基因稳定转染Panc-1细胞系的建立

实验采用PCR法获得CD1d基因片段,将其插入慢病毒pReceiver-Lv201载体（带GFP荧光）中获得EX-S0249-LV201重组质粒,经转染试剂EndoFectin-Lenti转染到293T细胞中获得慢病毒LP-S0249-LV201,用包装获得的慢病毒感染胰腺癌Panc-1细胞,在不同时间段用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,并用反转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法验证获得的表达细胞株.实验结果显示经RT-PCR和Western blotting检测证实慢病毒LP-S0249-LV201 转染至Panc-1细胞株后,该细胞株表达CD1d基因和蛋白,成功建立了稳定表达CD1d基因的Panc-1细胞系,为进一步研究CD1d基因在胰腺癌免疫基因治疗中的作用奠定基础.     

稀疏表达模型在高光谱遥感影像目标探测中的应用

为了更好地利用高光谱影像的空间和光谱信息,提出了一种基于稀疏表达模型的高光谱遥感影像目标探测方法.首先通过对影像训练样本进行训练提取过完备字典,利用稀疏表达模型对遥感影像稀疏表达既达到降维的目的,又可以表示出遥感影像的主要信息;然后利用传统的目标探测器结合目标已知光谱信息对高光谱遥感影像进行目标探测,即基于稀疏表达模型的高光谱遥感影像目标探测(SRM-TD).3种影像数据的实验结果表明:在确定的迭代次数下,通过设置稀疏度L可以得到最优的探测结果.提出的探测方法在参数设置、选择和运行结果上优于传统的高光谱遥感影像目标探测方法.     

Inhibition of the growth of human hepatoma cell line both in vitro and in vivo by transducing CKI gene p21WAF-1 with GE7 targeting gene delivery system

The EGF receptor-mediated targeting gene delivery system GE7 was used to transduce exogenous gene pCEP-p21WAF-1 into human hepatocellular carcinoma cell both in vitro and in vivo. After in vitro transduction of the exogenous gene, the growth of the cell lines SMMC-7721 and BEL-7402 was significantly inhibited compared with the control. On day 8 the inhibition rates of the above cell lines reached 56.0% and 66.7%, respectively. The in vivo experiment showed that the growth of human hepatoma transplanted in nude mice injected with GE7 gene delivery system subcutaneously once a week for 3 weeks was remarkably inhibited compared with that of untransfected control. The average tumor weight of the experiment group was (0.083 ± 0.043) g, while that of the control group was (0.281± 0.173) g. The difference is significant (P<0.05). It was indicated that GE7 gene delivery system could efficiently transduce exogenous gene pCEP-p21WAF-1 into hepatoma cell with high EGF receptor expression, and inhibit the cell growth with high efficacy both in vivo and in vitro.     

小圆蓝细胞瘤预测模型研究

为研究肿瘤与基因之间的关系,分析了小圆蓝细胞瘤基因表达数据,建立了分类和预测小圆蓝细胞瘤4 个亚型的多模预测模型.针对小圆蓝细胞瘤的4个亚型,该预测模型创建了4个基于神经网络的分类器,并编 码4个分类器的分类结果,获得每个数据样本的最终预测结果.研究表明,将复杂的多类分类问题分解为多个2 类分类问题是解决多类分类问题的有效方法,基于该方法建立的多模预测模型能够学习基因表达数据中蕴含的 知识,并利用获得的知识准确地分类和预测全部83个数据样本.