用RAPD技术对我国栉孔扇贝野生种群与养殖群体的遗传结构及其遗传分化的研究

利用RAPD技术对我国栉孔扇贝野生种群和养殖群体的遗传结构及其分化进行了研究，在对20个野生栉孔扇贝和20个养殖栉孔扇贝的基因组DNA的检测中，20个10碱基的随机引物共扩增出153条清晰可分辨的DNA片段，片段的长度为200－3000bp其中多态性片段分别为116和112条，野生种群和养殖群体的多态位点比例分别为75．82％，和73．47％，杂合度分别为0．27和0．26。根据基因频率计算出两个群体的近交系数为0．00129，遗传距离为0．028。栉孔扇贝野生种群的多态位点比例和杂合度处于较高水平，说明我国栉孔扇贝野生种群的遗传多样性水平较高，种质资源尚处于较好状态，应制定相应的渔业生产和管理措施加以保护，养殖群体的多态位点比例和杂合度都低于野生种群，这与人工累代养殖过程中，群体较小，近交机会增加有关。     

栉孔扇贝×虾夷扇贝子一代杂种优势的RAPD分析

应用RAPD技术对栉孔扇贝×虾夷扇贝子一代的杂种优势进行了研究,对栉孔扇贝(C)、虾夷扇贝(P)及其正交F1(C♀×P♂)、反交F1(P♀×C♂)共4个群体的RAPD扩增带谱进行了分析。从40个随机引物中筛选出16个扩增带丰富的引物进行扩增,共得到l15条清晰稳定的扩增带,扩增片段大小在200～2000bp之间,其中有82个扩增位点具有多态性,多态性位点比率为71.3%。栉孔扇贝与正反交子代的相对遗传距离分别为0.0852和0.2886;虾夷扇贝与正反交子代的相对遗传距离分别为0.2327和0.0559,杂种子代与两亲本的遗传差异不是对等的,而是偏向各自的母本,系统树、Shannon多样性指数同样证明了这一点。两亲本群体内相似性指数分别为0.8392和0.8451,均大于正交子代的群体内相似性指数,而小于反交子代的群体内相似性指数,表明正交子代群体的遗传多样性水平升高,产生杂种优势;反交降低,未产生明显的杂种优势,与4个群体Shannon遗传多样性指数计算分析结果一致。     

扇贝种间单对杂交一代幼虫ISSR标记的分离方式

通过对栉孔扇贝♀和华贵栉孔扇贝舍单对培育的♂个全同胞F1幼虫进行ISSR标记,分析了双亲位点在杂交子代中的传递分离方式。所得到的总位点数中双亲和杂交子代共有位点1#家系占35．4％,2#家系占27．1％,两单亲与杂交一代共享位点将近占30％左右,表明双亲所携带的遗传物质皆传递给了F1代,证实种间杂交的成功。但杂交种F1从栉孔扇贝获得的位点数稍多于华贵栉孔扇贝,且前者的位点在F1中出现频率明显高于后者。另外F1的每个个体与栉孔扇贝的遗传距离皆小于与华贵栉孔扇贝的距离,说明杂交子代在遗传上明显地偏向母本栉孔扇贝。另外在杂交子代中出现了较高比例的非孟德尔分离位点和非亲位点。     

栉孔扇贝种群的遗传变异分析

采用不连续聚烯酰胺凝胶电泳技术研究了中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝两个天然种群的六种同工酶。结果表明,两个种群具有基本相同的基因位点控制同工酶的表达,二者都具有居群内的个体差异,中国和日本的两个种群的多态位点比例（P．99）分别为41．18％和45．45％,平均杂合度观测值（Ho)分别为0．1295和0．1531,平均杂合度预期值（He)分别为0．1695和0．2331,各位点平均等位基因数（Ne)分别为1．5294和1．6363。日本栉孔扇贝自然种群的遗传变异明显高于中国栉孔扇贝自然种群。同时各群体中普遍存在杂合子缺失现象。     

栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

栉孔扇贝不同地理群体的遗传多样性分析

应用AFLP技术对栉孔扇贝的中国长岛群体和韩国东部、西部群体进行了遗传多样性分析。实验表明，中国长岛群体的群体内遗传相似度最高，为0．6754，韩国东部群体次之，为0．6714，韩国西部群体最低，为0．6309；中国长岛群体与韩国东部、西部群体间的遗传距离分别为0．1703和0．1786，韩国两群体间的遗传距离只有0．057。这一结果说明，长岛群体与韩国群体遗传差异较大，韩国两个群体遗传相似度较高，应视为同一个群体。本研究共获得6个韩国两群体的共享特征标记，4个长岛群体的特异性标记，1个韩国西部群体所特有的标记，这些标记可以用于鉴定和区分这三个群体。为提高我国栉孔扇贝群体遗传多样性，以引进韩国西部群体为好。     

中日栉孔扇贝杂交子一代群体的遗传变异

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，研究了中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝的两组杂交子代群体的14个位点24个等位基因。将它们各自的自交子一代作为亲本的参照组，对这四组子代群体进行了遗传变异分析，结果表明：四组群体具有相同的基因位点控制同工酶的表达，但各位点等位基因的频率有所不同。统计结果表明：杂交群体的遗传变异明显高于自交群体的遗传变异，四组群体的多态位点比例（P.99）分别为36.36%（CP中自交组）、30.77%（JP日自交组）、30.77%（JFCM日雌中雄杂交组）、30.77%（JM-CF日雄中雌杂交组），平均杂合度观测值（Ho）分别为0.1273（CP）、0.1055（JP)、0.1536（JFCM）、0.1727（JMCF)，各位点平均有效等位基因数（Ae）分别为0.7318（CP）、1.6718（JP）、1.6955(JFCM)、1.6927（JMCF）。杂交优势已初步显示出来。     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染与疾病发生关系探讨

超薄切片和负染色技术检测栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染状况，结果表明：在栉孔扇贝大规模死亡的7、8月份，病毒检出率分别为80％、100％，此时，病毒感染强度也达到最高；而海湾扇贝整个养殖期间病毒感染率和感染强度均维持在较低的水平，未出现明显的涨落。二种扇贝均检测到类立克次氏体（RLO），但类立克次氏体的感染率和感染强度均未出现明显的涨落，似与扇贝死亡的关系不大。综合分析认为，病毒极可能是导致栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。     

免疫多糖对栉孔扇贝血淋巴中氧化酶活力的影响

于栉孔扇贝体中分别注射酵母聚糖和硒多糖两种免疫多糖后,分别测定了栉孔扇贝血清和血细胞中两种参与免疫防御的酚氧化酶（PO）和髓过氧物酶（MPO）的活力。结果表明,注射酵母聚糖后,血清中PO活力仅在1h时实验组极显著地高于对照组,而血细胞中无PO活力,注射硒多糖后,血清中PO活力在1和15h时时显著高于对照组,而血细胞中未检测到PO活力：血清中MPO活力在1、15和30h时,血细胞中MPO活力在1和15h时实验组显著高于对照组,说明酵母聚糖和硒多糖两种免疫多糖对栉孔扇贝血淋巴中PO和MPO的活力均有增强作用。     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

栉孔扇贝的急性病毒性坏死症(AVND)病毒多克隆抗体的制备及ELISA分析

以青岛太平角养殖海区患病栉孔扇贝组织中提纯的急性病毒性坏死症病毒作为抗原，制备出效价较高的多克隆抗体。用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法对青岛黄岛等不同养殖海区、不同时间采集的栉孔扇贝材料进行检测，结果表明，7、8月份样品检测结果呈强阳性，检出阳性率为75％～95％，其他时期阳性率较低。     

扇贝异源四倍体诱导后代的细胞遗传学研究

采用50mg/L 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)处理15min抑制栉孔扇贝(Chlamys farreri♀)×虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis♂)异源受精卵第一极体的释放诱导扇贝异源四倍体.采用基因组荧光原位杂交技术(GISH)结合染色体滴片技术对扇贝异源四倍体诱导后代的染色体遗传构成进行研究,对授精后17～66h内6个时间段各300多个分裂相进行统计分析.结果表明,诱导异源四倍体过程中产生了多种倍性的幼虫,包括5.192%的四倍体、16.577%的三倍体以及单倍体、二倍体、五倍体和大量的非整倍体.在17～66h内同一组染色体数,所占比率并未出现随着取样时间的变化而发生明显上升或下降的趋势.在染色体构成上,诱导后代都分别继承了双亲的染色体,除正常杂交产生的异源二倍体外均为非对称性继承.GISH鉴定结果表明本实验所诱导的四倍体为真正的异源四倍体,同时也说明两套异源染色体具有较强的亲和性.在诱导后代中还出现了较小比例的染色体不完全继承个体.对产生这些现象的可能原因进行了探讨.     

栉孔扇贝四倍体幼虫的诱导研究

以栉孔扇贝Chlamys farreri为材料，采用浓度为0．5mg／L的细胞松弛素B(CB)处理、抑制受精卵第一极体排放的方法，进行四倍体诱导研究。5次重复实验结果表明，诱导组和对照组的平均受精率分别为45．0％和56．6％，D形幼虫的平均孵化率分别为5．3％和51．1％。经胚胎和幼虫发育观察发现，在诱导组中异常原肠胚的比例高于对照组；受精后48h，诱导组的滞育担轮幼虫的比例显著高于对照组。在受精后48h采用流式细胞术检测孵化的D形幼虫，诱导组中四倍体幼虫的比例为36％-70％，平均为49％，同时发现了平均比例为31％的三倍体幼虫。本研究表明，该项技术能有效地诱发栉孔扇贝四倍体幼虫，但面临四倍体幼虫孵化率低的问题，今后应设法提高四倍体胚胎和幼虫的发育水平。     

温度刺激下栉孔扇贝不同组织热休克蛋白HSP70的表达研究

采用免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)方法,研究了热激栉孔扇贝不同组织内热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达变化。免疫印迹结果显示,HSP70的诱导表达有组织特异性,即热休克可以使扇贝鳃组织中HSP70的表达明显升高,但在肌柱、外套膜和性腺组织中,未检测到HSP70的表达。流式细胞术结果表明：在不同的季节,相同的热刺激对扇贝血淋巴中HSP70的诱导表达存在差异。高温刺激后,栉孔扇贝血淋巴细胞中HSP70的表达量逐渐升高,在诱导7h时达到最高。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒感染的ELISA检测

应用纯化病毒免疫新西兰兔制备的抗血清，进行ELISA分析，检测栉孔扇贝体内急性病毒性坏死症病毒的感染情况。结果表明：一龄贝在整个养殖期间感染该病毒呈现低一高一低的涨落过程，其中7月下旬到8月中旬检出阳性率为75％～95％，为当年感染的高峰时期。对二龄贝感染该病毒的分析结果显示，二龄贝对病毒的感染可能具有一定的抗性。     

微卫星标记技术在大豆遗传作图中的应用

根据文献报道的序列有选择地合成了２０对ＳＳＲ引物,在用以遗传作图的两个亲本中进行了扩增,有１７对引物的扩增产物具有多态性大小范围为７０－３００ｂｐ。其中扩增产和大小差异小于１０－２０ｂｐ的等位基因可通过４％琼脂糖凝胶电脉分开,介绍了多次眯样和多引物ＰＣＲ技术。Ｘ＾２显著性检验证明其符合孟德尔式遗传方式,遗传连锁分析表明其中三个微卫星标记加锁