牙鲆选择性养殖群体遗传结构的微卫星分析

应用10对微卫星引物对三个牙鲆群体各30个个体进行了群体遗传多样性分析.普通群体的平均等位基因数为7.6,显著高于感病群体的5.80,略高于抗病群体的7.2.普通群体的10个位点的平均基因型数为11.4,而感病群体和抗病群体分别只有8.3和9.0.普通群体的平均有效等位基因数为3.97,略高于感病群体和抗病群体的3.78和3.72.普通群体10个位点最高频率等位基因的平均频率值为0.388,而感病群体和抗病群体分别为0.407和0.425.普通群体低频等位基因(0-0.05)总共有27个,而感病群体和抗病群体分别只有15个和19个.普通群体共得到14个私有等位基因,感病群体和抗病群体仅各得到3个等位基因.研究结果表明了感病群体和抗病群体两个选择性养殖群体遗传多样性的降低.     

牙鲆同质雌核发育人工诱导研究

采用紫外线照射对牙鲆(Paralichthys olivaceus)精子遗传物质进行完全灭活,灭活精子与牙鲆卵子授精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克或静水压法对其进行倍性恢复,成功诱导出同质雌核发育牙鲆.牙鲆精子遗传灭活的最适紫外照射剂量为3.6×10-3J/mm2(照射时间为180s);(15±0.2)℃水温下冷休克法诱导的最适条件为受精后85min,0～2℃水温处理45min;静水压法的最适诱导参数为受精后85min,600kg/cm2压力处理6min,诱导效率静水压法明显高于冷休克法.两种方法诱导组胚胎发育较对照组在原肠期前都有明显滞后现象,开口前同质雌核发育仔鱼比异质雌核发育仔鱼存活率低,但二者全长生长无显著差异(P＜0.05).这些结果为牙鲆纯系建立及其应用提供了重要依据.     

牙鲆连续三代减数分裂雌核发育家系的遗传特征分析

通过对连续两代减数分裂雌核发育牙鲆(Paralichthys olivaceus)再度诱导减数分裂雌核发育,首次获得三个连续三代减数分裂雌核发育二倍体家系(Meio-G3-1,Meio-G3-2,Meio-G3-3)。选用重组率高、中、低的30对微卫星引物,分析该三个家系的遗传构成。30个微卫星位点在三个家系中扩增到的等位基因数分别为35、38、37,平均等位基因数为1.17、1.27、1.23,平均观测杂合度(Ho)分别为0.1467、0.2556、0.2056,平均纯合度分别为0.853 3、0.744 4、0.794 4。三个家系内个体间的平均遗传相似度为0.991 3、0.991 8、0.983 8,母本与子代之间的平均遗传相似度为0.994 6、0.996 8、0.992 3,三个家系间的遗传相似度分别为0.971 7(Meio-G3-1和Meio-G3-2)、0.981 0(Meio-G3-1和Meio-G3-3)、0.971 4(Meio-G3-2和Meio-G3-3)。结果表明,连续三代诱导雌核发育能进一步提高个体的纯合度、个体间以及家系间的平均遗传相似度,是快速建立鱼类近交系的良好方法。     

应用微卫星标记分析柱花草的遗传多样性

采用18个微卫星(SSR)DNA标记对42个柱花草品系进行了遗传多样性分析，共扩增出84条带，其中多态性带71条，平均多态性水平为84．5％。运用POPGEN32软件计算了各品系的等位基因频率、多态性信息含量、遗传杂合度、等位基因数及有效等位基因数，结果表明，抗病柱花草品系的遗传变异高于感病柱花草品系的遗传变异程度。用NTSYS-pc软件计算品系间的遗传相似系数，其变化范围为0．26～0．94。按非加权成对平均数法(UPGMA)进行聚类分析，获得了聚类树系图，以所有品系的平均遗传相似系数0．60为阈值，42个品系分为6类。这些结果表明，SSR技术是分析柱花草遗传多样性的有效方法。     

栉孔扇贝EST中微卫星标记的筛选

使用RepeatMasker软件在栉孔扇贝的6935条ESTs中发现了42条微卫星序列。选取其中的7个序列,根据微卫星位点的旁侧序列设计引物,并对设计出的引物在中国、日本、韩国野生群体中进行多态性检测,发现有6对引物能产生扩增产物,其中有3对引物可望在以后的群体分析及连锁图谱的构建中加以应用。该结果初步证实了在栉孔扇贝的ESTs序列中存在微卫星位点,从而为扇贝生物中微卫星标记的筛选开辟了新的途径。     

异源精子诱导大黄鱼雌核发育的研究

使用未经失活的浅色黄姑鱼精子诱导大黄鱼雌核发育,获得了大黄鱼雌核发育单倍体.对单倍体受精卵实施压力休克,能够产生正常存活的大黄鱼雌核发育二倍体.最佳实验为:在20℃下,受精后3min,然后对受精卵施加45MPa的压力,持续2 min.在这种情况下相对孵化率可达88.5%.在染色体加倍的操作中,染色体未被成功加倍的胚胎由于单倍体的致死效应,在孵化前后死亡,从而保证了存活的仔鱼为大黄鱼雌核发育二倍体.该方法的建立为海水养殖的大黄鱼品种的改良提供了技术基础.     

应用微卫星标记研究西藏野生二棱大麦的遗传多样性及地理分化

用来自大麦7个连锁群不同位置的35个SSR标记研究了西藏不同地区的50份野生二棱大麦(H．spontaneum)的遗传多样性及地理分化。结果表明：SSR的多态性高,其多态性DNA片段比例达97．44％;每个SSR位点检测到l～14个等位变异(4．04个／位点);西藏山南地区的遗传多样性和等位变异数最高,分别为0．4933和3．35。变异的1．08％～37．54％(平均为13．09％)是由于地区的差异引起,表现出一定程度的地理分化。最后,讨论了SSR引物的选择及SSR标记的可靠性和西藏野生大麦的起源问题。推测西藏山南地区可能是西藏野生二棱大麦的起源中心,也是西藏野生大麦和中国栽培大麦的起源中心。     

灭活病毒诱导牙鲆传代细胞差减cDNA文库的构建及分析

以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR扩增后,取正向差减的PCR产物与T载体连接,构建抑制差减cDNA文库,随机挑取7400余个克隆,对其中4200多个克隆进行PCR扩增鉴定,发现近4000个克隆中均含有插入片段,大小在250～1000bps之间,进一步对含有插入片段的近4000个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。     

牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列。重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh,转化大肠杆菌BL21(DF3),筛选阳性克隆,IVIG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18．3％。该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性。     

三种鲆鲽鱼养殖群体的遗传多样性及特异性AFLP标记研究

应用AFLP技术对条斑星鲽、星斑川鲽及漠斑牙鲆的养殖群体进行遗传分析。8对EcoRI／MseI 引物在条斑星鲽、星斑川鲽、漠斑牙鲆养殖群体中分别得到196、207、187条扩增带。其群体的多态位点比例分别为26.02％、25.12％、39.57％,Nei遗传多样性指数和Shannon遗传多样性指数分别为0.1101和0.1587,0.1008和0.1465,0.1566和0.2238。结果表明,条斑星鲽和星斑川鲽养殖群体的遗传变异水平相对较低,而漠斑牙鲆的遗传变异水平相对较高。同时还筛选获得了这3种鲆鲽鱼的共享标记19个,种的特有标记依次为44、45、34个。并根据两两间的遗传距离构建了UMPGA聚类关系图,从分子生物学角度衡量了其亲缘关系。     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因.牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp,序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子.cDNA全长588bp,包含一个270bp的开放阅读框,编码一个长89氨基酸的前体肽.RT-PCR分析表明:该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高,在心脏、小肠中表达量较低;受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升.牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源,为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据.     

牙鲆红细胞免疫功能的初步研究

通过尾静脉采血收集养殖牙鲆的外周血细胞,以金黄色葡萄球菌作为吞噬原测定了外周血细胞的免疫吞噬活性.结果表明,牙鲆外周血中至少存在3种形态的白细胞具有明显的吞噬活性,吞噬指数和吞噬百分率分别为1.95±0.25和(21.1±1.4) %.首次观察到牙鲆红细胞具有较强的吞噬能力、变形能力和免疫粘附能力,表明牙鲆红细胞除具有运输O2和CO2的机能外,还具有重要的免疫防御功能.同时发现牙鲆外周血细胞的吞噬活性在不同温度下表现不同,在相对低温条件下(15℃)表现最高,与牙鲆生活的最适水温16～21℃接近,而在35℃时吞噬活性最低,表明温度会影响牙鲆血细胞的吞噬活力.     

牙鲆GH基因外显子多态性与生长性状关系的初步研究

以一个牙鲆养殖群体中的100个个体为实验材料,根据其生长激素(GH)基因的五个外显子序列设计引物,进行PCR扩增,通过SSCP分析技术对其进行检测,结果表明该群体生长激素基因的第四个外显子存在多态性.共检测到两种基因型,其中AA型个体占88%,AB型个体占12%;DNA测序结果表明,AB型在第1763位发生碱基突变,c→t,与AA型同源性达到99%,同时发现不同基因型的个体在体重和头长上表现出显著的差异(P＜0.05).上述结果表明利用PCR-SSCP技术可以检测到牙鲆生长激素基因外显子部分存在序列遗传多态性,且该多态性与其生长的某些性状具有一定的连锁关系,为将来进行标记辅助选育奠定了基础.     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在大肠杆菌中的融合表达

根据从实验室克隆的牙鲆抗菌肽hepcidin基因(GenBank登陆号DQ129693)的序列,设计了特异性引物,PCR扩增其成熟肽片段.重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成牙鲆抗菌肽hepcidin基因融合表达载体pGEX-fhep,转化至大肠杆菌BL21(DE3)plyS中,筛选得到的阳性克隆用IPTG进行诱导.SDS-PAGE电泳显示在29kD处有特异性的蛋白条带出现,Western-blotting 检测表明已经成功表达了融合蛋白,表达的融合蛋白最高占总蛋白的21%.纯化得到的GST-fhep用凝血酶切割后,用亲合层析得到牙鲆的抗菌肽hepcidin.抑菌实验结果表明抗菌肽对大肠杆菌(ATCC25922)有一定程度的抑制作用.     

牙鲆促性腺激素释放激素基因cGnRH-II和sbGnRH的克隆与表达特征分析

采用RACE和RT-PCR方法,从牙鲆脑组织中克隆获得了两种牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II(DQ008580)和sbGnRH(DQ074693)的cDNA全基因序列,其长度为607 bp和395 bp,分别编码85和98个氨基酸的GnRH前体,均包含一个信号肽、具有活性的GnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的GnRH相关肽.氨基酸同源性比较表明,牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II与其他鱼类的cGnRH-II基因有较高的同源性,如与鲽科鱼类条斑星鲽的相似性为97.6%,但与哺乳类、爬行类和两栖类动物的同源性较低;sbGnRH与条斑星鲽的相似性为86.7%.采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在成熟牙鲆个体中的表达,结果表明该两基因在脑区、垂体和性腺中皆有表达,但sbGnRH基因的体内表达部位稍多于cGnRH-II.     

牙鲆自然杀伤细胞增强因子(NKEF)全长cDNA的克隆及表达分析

采用快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA ends,RACE）的方法,分离和测定了牙鲆自然杀伤细胞增强因子（NKEF）cDNA的全长核苷酸序列,5’RACE扩增分离得到了400bp左右的片段,3’RACE扩增得到了800bp左右的片段,经过拼接得到了牙鲆NKEF全长cDNA序列。牙鲆NKEF cDNA全长1028bp（不包含polyA）,其中包括67bp的5’非翻译区、597bp的开放阅读框和364bp的3’非翻译区（不包含polyA）,整个开放阅读框编码198个氨基酸。RT—PCR分析表明,NKEF基因在牙鲆不同组织中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。研究结果为提高牙鲆自身免疫防御能力的研究提供了理论依据。     

抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备

用本实验室分离纯化的淋巴囊肿病毒(Lymphosystis Disease Virus China,LCDVcn)作为抗原,感染BALB／c小鼠,取被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2／0融合;ELISA法检测、筛选阳性克隆,经过3次克隆化,首次成功获得18株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。     

胶原酶消化法纯化牙鲆淋巴囊肿病毒(Lymphosystis Disease Virus China,LCDV-cn)

先后采用各种胶原酶和疏水性制剂,消化、水解病鱼囊肿细胞中带状包涵体外围的胶原蛋白和糖蛋白。经过设计蔗糖密度梯度离心条件,成功分离出了大量的LCDV-cn粒子,并最终建立起一套较完备的、分离纯化LCDV-cn的方法。