小体鲟卵透明带家族ZP3亚型和ZPAX基因cDNAs克隆及其组织表达分析

为研究透明带ZP家族在小体鲟Acipenser ruthenus性腺发育、卵子发生等过程中所发挥的作用,采用PCR技术克隆获得小体鲟卵透明带家族ZP3 3种亚型(ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5)及ZPAX基因(ArZPAX)cDNA部分序列。结果表明:ArZP3-1部分cDNA序列长度为1029 bp,对应编码342个氨基酸;ArZP3-4部分cDNA序列长度为1191 bp,对应编码397个氨基酸;ArZP3-5部分cDNA序列长度为717 bp,对应编码238个氨基酸;ArZPAX部分cDNA序列长度为733 bp,对应编码243个氨基酸;ArZP3蛋白3种亚型及ArZPAX蛋白氨基酸序列中均含有一个保守的ZP结构域;基于ZP氨基酸序列的系统发育树显示,小体鲟ArZP3蛋白3种亚型与高等鱼类ZP3亲缘关系较近,而ArZPAX蛋白则与哺乳类、鸟类、高等鱼类和爬行类ZPAX亲缘关系均较远;通过半定量RT-PCR进行组织表达特异性分析表明,ArZP3-1基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、脑、肾、心、肌肉、鳃中表达,ArZP3-4基因仅在小体鲟卵巢和精巢中表达,而ArZPAX基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、肠、肾、脾、心、鳃、脑中均有表达,3个基因在性腺中的表达量均最高,且均具有雌、雄差异性表达特点。     

西伯利亚鲟MHCⅡβ基因克隆、组织分布及细菌感染后的表达变化

为研究鲟鱼主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)基因的分子特征和表达,利用RACE技术克隆获得了西伯利亚鲟Acipernser baerii MHCⅡβ cDNA序列1443 bp,包括开放阅读框(OFR)801 bp,编码184个氨基酸。Blast分析显示,由MHCⅡβcDNA基因推导的氨基酸序列同其他物种的一致性为46%～83%,通过Smart站点分析,该序列具有SMART MHC_Ⅱ_beta结构域、SMART IGc1结构域和跨膜螺旋结构域;实时定量分析表明,正常情况下MHCⅡβ mRNA在西伯利亚鲟10种组织中均有表达,其中脾、头肾和血液中表达量较高,皮肤和肉中表达量极低(P<0.05);感染维氏气单胞菌Aeromonas veronii 40 h后,脾脏中MHCⅡβ mRNA的表达量显著低于未感染的对照组(P<0.05),直至93 h时恢复至对照组水平且有显著性变化(P<0.05)。研究表明,MHCⅡβ基因参与了西伯利亚鲟的免疫反应。     

西伯利亚鲟MHCⅡβ基因克隆、组织分布及细菌感染后的表达变化

为研究鲟鱼主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)基因的分子特征和表达,利用RACE技术克隆获得了西伯利亚鲟Acipernser baerii MHCⅡβ cDNA序列1443 bp,包括开放阅读框(OFR)801 bp,编码184个氨基酸。Blast分析显示,由MHCⅡβcDNA基因推导的氨基酸序列同其他物种的一致性为46%～83%,通过Smart站点分析,该序列具有SMART MHC_Ⅱ_beta结构域、SMART IGc1结构域和跨膜螺旋结构域;实时定量分析表明,正常情况下MHCⅡβ mRNA在西伯利亚鲟10种组织中均有表达,其中脾、头肾和血液中表达量较高,皮肤和肉中表达量极低(P<0.05);感染维氏气单胞菌Aeromonas veronii 40 h后,脾脏中MHCⅡβ mRNA的表达量显著低于未感染的对照组(P<0.05),直至93 h时恢复至对照组水平且有显著性变化(P<0.05)。研究表明,MHCⅡβ基因参与了西伯利亚鲟的免疫反应。     

鳜胰岛素样生长因子-Ⅱ cDNA基因的克隆与表达特征

为全面获得鳜Siniperca chuatsi GH-IGFs生长发育轴的调控因子特征,采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了肝组织胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)cDNA序列。结果表明:鳜IGF-ⅡcDNA全长为1 643 bp,包括5'端非翻译区103 bp、3'端非翻译区892 bp和开放阅读框648 bp,开放阅读框编码215个氨基酸;鳜IGF-Ⅱ前肽由信号肽、成熟肽和E肽3部分组成,其中信号肽为47个氨基酸,成熟肽为70个氨基酸,E肽为98个氨基酸;鳜IGF-Ⅱ氨基酸序列与其他脊椎动物的相似度为81%～98%,与鳜IGF-Ⅰ的相似度为62.5%。运用实时荧光定量PCR技术检测了鳜成鱼不同组织以及孵化后0～22 d仔稚鱼中IGF-ⅡmRNA的表达情况,结果表明:IGF-ⅡmRNA在鳜脑中表达量最高,在肌肉、心脏、胃、鳃、肾脏中表达量次之,在脾、前肠、后肠、性腺、肝脏中表达量较低;在孵化后早期发育阶段均检测到有IGF-ⅡmRNA表达,孵化当天(0 d)表达量最高,之后表达量有所降低。本研究结果可为鳜IGF-Ⅱ对生长发育的调控作用研究提供科学依据。     

红鳍东方鲀感染哈氏弧菌前后组织中socs3基因的表达差异分析

为研究红鳍东方鲀Takifugur ubripes免疫系统相关细胞因子信号传导抑制因子-3(Suppressor of cytokine signaling,SOCS3)的表达情况,采用相对实时荧光定量PCR方法比较了体质量为(290.34±5.13)g的健康红鳍东方鲀脑、脾脏、肠、鳃、肌肉和肝脏6个不同组织中socs3基因表达量,以及感染哈氏弧菌Vibrio harveyi后肝脏、脾脏和肠组织socs3基因表达量的变化。结果表明:socs3基因在健康红鳍东方鲀肝脏组织、肌肉组织中均有显著表达(P<0.05),在鳃、脑、脾脏、肠组织中表达不显著(P>0.05);感染哈氏弧菌的红鳍东方鲀,在感染后的24、48 h时,肝脏组织socs3的表达量显著高于0 h(P<0.05),分别约为初始时的10倍和8倍,其他组织变化不明显(P>0.05);利用NCBI的ORF Finder程序鉴定所得红鳍东方鲀SOCS3(NP_001072096.1)序列的潜在开放阅读框(ORF),通过模块化结构研究工具来鉴定保守结构域和信号肽,表明socs3的cDNA序列全长1533 bp,其中5′端非编码区为215 bp,开放阅读框(ORF)长度为606 bp,3′端非编码区为713 bp,共编码201个氨基酸;利用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列比对并构建系统发育树,结果显示,硬骨鱼类单独聚为一支,与哺乳动物、两栖动物及鸟类分开,硬骨鱼类中的SOC3b单独聚为一支,红鳍东方鲀与其同科的黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis的SOC3聚在一起,并与三刺鱼Gasterosteus aculeatus属于同一分支。本研究结果可为红鳍东方鲀免疫应答的研究提供数据支持。     

双齿围沙蚕Hsp70 cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知巨型管状虫Riftia pachyptila热休克蛋白70(Hsp70)基因序列设计引物,应用同源克隆策略和RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis体壁肌肉中克隆获得Hsp70 cDNA序列。结果表明:双齿围沙蚕Hsp70 cDNA序列全长为2 336 bp,包括5'端非翻译区88 bp、3'端非翻译区286 bp和开放阅读框1 962 bp;整个开放阅读框编码653个氨基酸,包含Hsp70家族3个特征区域;通过生物信息学分析表明,该蛋白是一种无信号肽跨膜蛋白,理论等电点为5.14,相对分子质量为71 396,半胱氨酸(Cys)含量为0.8%;同源性分析表明,双齿围沙蚕Hsp70氨基酸序列与其他真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性。该研究结果可为进一步开发沙蚕Hsp70作为监测海洋污染的一种生物标记物提供重要的参考依据。     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明:双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5'端非编码区,261 bp 3'端非翻译区和453 bp开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15 249 900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

西伯利亚鲟免疫球蛋白M重链区mRNA的组织分布和细菌感染后的表达

根据GenBank登录的西伯利亚鲟Acipernser baerii免疫球蛋白M重链区mRNA(IgHM mRNA)设计引物,进行SYBR green实时定量。结果表明:鲟的脑、鳃、性腺、心脏、后肠、肝脏、肌肉、脾脏8种组织中,IgHM mRNA在脾脏中表达最高,在肝脏和心脏中表达较少,在脑、鳃、性腺、后肠、肌肉5种组织中几乎不表达;在水温22.6²4.5℃时,按100 g体质量注射0.1 mL菌液,给体质量为(260.2±37.8)g的西伯利亚鲟注射浓度为2.0×107CFU/mL的维氏气单胞菌Aeromonas veronii,注射后40 h鱼开始死亡,62 h后停止死亡,注射后直至62 h时,处理组脾脏IgHM mRNA表达量一直处于对照组水平,93 h时处理组脾脏IgHM mRNA显著升高(P<0.05),为93 h对照组含量的3.7倍,说明机体已经开始特异性免疫应答。     

菲律宾蛤仔RP2基因的克隆及组织表达分析

采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa¹75aa)和CARP(65aa175aa)和CARP(65aa¹02aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%⁵3%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P<0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。