杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系的建立及应用

为研究杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的形成机制,探寻其产业化生产的有效途径,通过对GISH的多项试验参数进行优化,建立杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系,并对天然四倍体泥鳅(4n=100)与大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus(2n=48)正、反杂交后代进行GISH分析。结果表明:杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系中,探针DNA在温度为105℃、持续时间为2 min时,片段化后探针DNA片段长度为500¹000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为1001000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为100⁵00bp;标记后的探针DNA与片段化后的封阻DNA混合比(P/B)在1∶25和1∶50时均可以得到较好的杂交信号;以大鳞副泥鳅全基因组DNA为探针DNA、天然四倍体泥鳅全基因组DNA为封阻DNA,与二者正、反交后代进行基因组原位杂交试验,结果显示,来源于亲本大鳞副泥鳅24条染色体在着丝点处均有杂交信号,无杂交信号染色体50条,来源于亲本泥鳅。该研究结果不仅为杂交三倍体泥鳅后代的鉴定提供了最直观的证据,也为中国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体并能产生2n的配子提供了分子细胞遗传学基础数据,对泥鳅三倍体育种研究具有一定的指导意义。     

自然四倍体泥鳅雄核发育二倍体染色体组构成研究

为探究鱼类雄核发育新途径及自然四倍体泥鳅所产生的配子染色体组构成,采用自然四倍体泥鳅(4n=100)为父本、二倍体泥鳅(2n=50)为母本进行杂交,受精后5 min将受精卵放入3℃水中处理60 min诱导雄核发育二倍体泥鳅,并对其后代的血红细胞核体积、染色体核型、Ag-NORs带型及荧光原位杂交(FISH)信号等进行了研究。结果表明:对照组杂交三倍体泥鳅血红细胞核体积为(38.29±3.14)μm³,处理组雄核发育二倍体泥鳅血红细胞核体积为(27.92±3.58)μm3,处理组雄核发育二倍体泥鳅血红细胞核体积为(27.92±3.58)μm³,二者血红细胞核体积之比为1.37∶1;杂交三倍体泥鳅胚胎染色体数目3n=75,核型公式为15m+6sm+54t, NF=96,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体数目2n=50,核型公式为10m+4sm+36t, NF=64;杂交三倍体泥鳅胚胎染色体中,在3个染色体短臂的端部检测到3个FISH杂交信号,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体中,在2个染色体短臂的端部检测到2个FISH杂交信号;杂交三倍体泥鳅染色体和间期核中,呈现出Ag-NORs数目为1～3个,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体和间期核中,呈现出Ag-NORs数目为1～2个。研究表明,雄核发育二倍体泥鳅的染色体组构成为2套染色体组,表明自然四倍体雄性泥鳅能产生二倍体(2n)配子,该结果为自然四倍体雄性泥鳅是具有4套染色体组的遗传四倍体提供了重要的遗传学证据。     

杂交三倍体泥鳅×二倍体泥鳅杂交后代胚胎染色体组构成的研究

为探讨杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus配子染色体组的构成,以杂交三倍体泥鳅(3n)与二倍体泥鳅(2n)为研究对象,配制2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交组合,对杂交后代的胚胎染色体进行银染(Ag-NORs)、CMA_3/DA/DAPI三重荧光染色和染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等方面的研究。结果表明:两个杂交组合的杂交后代胚胎染色体有丝分裂中期分裂相中最高银染点数均为3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;在2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交后代胚胎染色体有丝分裂中CMA3阳性部位有3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;将核糖体5.8S+28S r DNA定位在杂交后代胚胎染色体上,两种杂交组合均可检测到3簇杂交信号,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域。研究表明,杂交三倍体泥鳅无论雌雄与二倍体泥鳅杂交所产生的后代染色体组构成均为3套染色体组,进而可推测,杂交三倍体泥鳅无论雌雄均可产生(1.5²)n的配子,该结果为三倍体泥鳅配子染色体组成提供了细胞遗传学证据。     

不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成的研究

以泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,通过染色体计数法,对二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正交(2n×4n)、反交(4n×2n)杂交后代的早期胚胎、6月龄及12月龄阶段的染色体数目进行了统计分析。结果表明:早期胚胎正、反杂交后代的染色体数目为67～81、67～82,在良好的中期分裂相(100、100个)中,染色体数目为75的整三倍体众数百分比最高(22%,20%),此外还有大量染色体数目<75的亚三倍体(37%,51%)和染色体数目>75的超三倍体(41%,29%);6月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～79、66～80,在良好的中期分裂相(58、63个)中,整三倍体(3n=75)众数百分比最高(26%,41%),此外还有大量亚三倍体(34%,49%)和超三倍体(40%,10%);12月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～82、69～83,在良好的中期分裂相(71、50个)中,三倍体(3n=75)众数百分比最高(28%,54%),此外还有大量亚三倍体(48%,20%)和超三倍体(24%,26%)。研究表明,二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正、反杂交后代均出现大量能存活的非整三倍体个体,并随养殖时间的延长,非整三倍体率呈下降趋势。     

不同倍性泥鳅鳍细胞培养及染色体标本制备方法的研究

以天然二倍体、杂交三倍体(4n♀×2n♂)和天然四倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的鳍组织为材料,对短期培养的消毒方法、秋水仙素的浓度(1.0、1.5、2.0μg/mL)与处理时间(2、3、4 h)和低渗处理时间(30、40、50 min)等细胞培养技术,及染色体标本制备方法进行了研究。结果表明:选择100 g/L的碘伏溶液杀菌效果良好,对于细胞生长影响较小,尤以处理15 min时的效果最明显,细胞迁出迅速;在终止培养前3 h加入秋水仙素至终浓度为1.5μg/mL,天然二倍体、杂交三倍体和天然四倍体泥鳅鳍细胞中期分裂相染色体众数最高,分别为93.33%、90.00%、70.00%;25℃下低渗处理40 min时,可以获得大量图像清晰、长度适中、分散良好、染色体数目完整的染色体中期分裂相。本研究中初步建立了以鳍组织培养法作为材料来源快速制备不同倍性泥鳅染色体标本的方法。     

中国洪湖不同倍性泥鳅的染色体组型及形态特征比较分析

以中国洪湖自然二倍体、三倍体、四倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,运用经典的形态测量观察方法、染色体制片技术对不同倍性泥鳅的染色体组型、形态特征进行比较分析。结果表明:1)二倍体泥鳅2n=50,核型公式为10m+4sm+36t,NF=64;三倍体泥鳅3n=75,核型公式为15m+6sm+54t,NF=96;四倍体泥鳅4n=100,核型公式为20m+8sm+72t,NF=128;2)5个比例性状测量结果显示,二倍体与四倍体很接近,没有表现出明显的差异,但两者与三倍体在眼后头长/体长(PL/SL)、后头部到鳃的距离/体长(LOOSR/SL)、背鳍前端到尾鳍的距离/体长(LODO-CB/SL)3个比例性状存在显著差异(P<0.05);3)主成分分析表明,二倍体、三倍体及四倍体形态差异主要系躯体后半部差异所致;(4)聚类分析结果显示,洪湖二倍体和四倍体相聚类,亲缘关系较近,与三倍体群体的聚类关系较远。     

鲤45S rDNA的染色体荧光原位杂交定位

应用荧光原位杂交技术,通过设计位于5.8S rDNA、18S rDNA和非转录IGS区域的3条探针CAAG1191、CAAG1845和CAAG3602,分别对散鳞镜鲤Cyprinus carpio var.scattered mirror和松浦鲤Cyprinuscarpio Songpu的45S核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)进行染色体定位及共定位。结果表明:45S rDNA均位于两品种鲤一对近端着丝粒染色体的短臂末端,具有染色体特异性,表明45S rDNA序列的探针能够在鲤细胞遗传学研究中用于标识其所在染色体,并与鲤遗传连锁图谱中长度为227 cM的1号连锁群相对应;两品种鲤的染色体数目均为2n=100,45S rDNA在鲤基因组内仅定位于一对同源染色体,不存在复制位点,证实了鲤基因组在全基因组复制事件之后又经历了重新二倍化过程。     

复方中草药对大鳞副泥鳅生长、消化酶及抗氧化能力的影响

为探讨复方中草药对大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus生长、体成分、消化酶和抗氧化能力的影响,试验设置对照组(不添加中草药)、复方Ⅰ组(板蓝根Radix isatidis、大黄Chinese rhubarb)、复方Ⅱ组(大青叶Folium isatidis、大黄)、复方Ⅲ组(黄芪Astragalus membranaceus、黄柏Phellodendron amurense Rupr.)、复方Ⅳ(甘草Glycyrrhiza uralensis、五倍子Galla chinensis)5个试验组,每组设3个平行,每个平行放体质量为(8.42±0.13)g的泥鳅30尾,各组饲料按基础饲料的3‰添加复方中草药(复方比例为1∶1),在室内15个水箱(80 cm×80 cm×100 cm)中进行了60 d的大鳞副泥鳅养殖试验。结果表明:复方Ⅰ组与复方Ⅲ组大鳞副泥鳅增重率、特定生长率均显著高于对照组(P<0.05);复方Ⅰ组饲料转化率显著高于对照组(P<0.05),复方Ⅱ组与复方Ⅲ组饲料转化率略高于对照组(P>0.05);复方Ⅰ组与复方Ⅱ组粗蛋白质含量略高于对照组(P>0.05);复方Ⅰ组、复方Ⅱ组与复方Ⅲ组粗脂肪含量显著高于对照组(P<0.05);肝胰腺胰蛋白酶活力以复方Ⅲ组最高(P<0.05),其余复方组肝胰腺胰蛋白酶活力与对照组相比无显著性差异(P>0.05),各复方组肠道中胰蛋白酶活力均显著高于对照组(P<0.05);大鳞副泥鳅肝胰腺与肠道中脂肪酶活力均以复方Ⅲ组最高;各复方组SOD活力均显著高于对照组(P<0.05);复方Ⅳ组与对照组的AKP活力显著低于其他3个复方组(P<0.05),对照组MDA含量显著高于各复方组(P<0.05),复方Ⅰ组与复方Ⅲ组T-AOC活力显著高于对照组(P<0.05)。研究表明,复方中草药可促进大鳞副泥鳅生长、消化,提高机体抗氧化能力,其中以复方Ⅰ组和复方Ⅲ组效果最佳。     

复方中草药对大鳞副泥鳅生长、消化酶及抗氧化能力的影响

为探讨复方中草药对大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus生长、体成分、消化酶和抗氧化能力的影响,试验设置对照组(不添加中草药)、复方Ⅰ组(板蓝根Radix isatidis、大黄Chinese rhubarb)、复方Ⅱ组(大青叶Folium isatidis、大黄)、复方Ⅲ组(黄芪Astragalus membranaceus、黄柏Phellodendron amurense Rupr.)、复方Ⅳ(甘草Glycyrrhiza uralensis、五倍子Galla chinensis)5个试验组,每组设3个平行,每个平行放体质量为(8.42±0.13)g的泥鳅30尾,各组饲料按基础饲料的3‰添加复方中草药(复方比例为1∶1),在室内15个水箱(80 cm×80 cm×100 cm)中进行了60 d的大鳞副泥鳅养殖试验。结果表明:复方Ⅰ组与复方Ⅲ组大鳞副泥鳅增重率、特定生长率均显著高于对照组(P<0.05);复方Ⅰ组饲料转化率显著高于对照组(P<0.05),复方Ⅱ组与复方Ⅲ组饲料转化率略高于对照组(P>0.05);复方Ⅰ组与复方Ⅱ组粗蛋白质含量略高于对照组(P>0.05);复方Ⅰ组、复方Ⅱ组与复方Ⅲ组粗脂肪含量显著高于对照组(P<0.05);肝胰腺胰蛋白酶活力以复方Ⅲ组最高(P<0.05),其余复方组肝胰腺胰蛋白酶活力与对照组相比无显著性差异(P>0.05),各复方组肠道中胰蛋白酶活力均显著高于对照组(P<0.05);大鳞副泥鳅肝胰腺与肠道中脂肪酶活力均以复方Ⅲ组最高;各复方组SOD活力均显著高于对照组(P<0.05);复方Ⅳ组与对照组的AKP活力显著低于其他3个复方组(P<0.05),对照组MDA含量显著高于各复方组(P<0.05),复方Ⅰ组与复方Ⅲ组T-AOC活力显著高于对照组(P<0.05)。研究表明,复方中草药可促进大鳞副泥鳅生长、消化,提高机体抗氧化能力,其中以复方Ⅰ组和复方Ⅲ组效果最佳。     

泥鳅MSAP技术反应体系的建立及优化

为获得不同倍性泥鳅基因组DNA甲基化水平及模式,以泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,利用正交试验建立了甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法的反应体系,并利用该方法对二倍体泥鳅鳍基因组DNA进行了MSAP分析。结果表明:最佳双酶切反应体系为800 ng的泥鳅基因组DNA,用EcoR I、Hpa II和Msp I各10 U,在37℃下反应8 h后即可酶切;最佳预扩增反应体系为模板4μL、预扩增引物0.8μL、0.2 mmol/L d NTPs、1.5 mmol/L Mg2+和Taq 1 U;最佳选择性扩增反应体系为预扩增产物稀释20倍的模板2μL、引物1.5μL、0.375 mmol/L d NTPs、1.5 mmol/L Mg2+和Taq 1 U;二倍体泥鳅全甲基化率分别为24.1%、20.8%、22.3%,半甲基化率分别41.4%、20.8%、33.3%,总甲基化率分别为65.5%、41.6%、55.6%。研究表明,该反应体系稳定、可靠、重复性好,为MSAP技术在多倍体泥鳅相关研究中的应用奠定了基础。