低聚壳聚糖对辐射损伤小鼠细胞凋亡的影响

从细胞凋亡角度探讨低聚壳聚糖提高辐射损伤动物存活率的机理。小鼠受到5 Gyγ射线照射后,检测骨髓淋巴细胞凋亡数、脾脏细胞凋亡相关基因和P53蛋白的变化。流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测凋亡基因,Western方法检测蛋白表达。与单纯照射组相比,低聚壳聚糖提高受照小鼠的存活率,降低骨髓淋巴细胞的凋亡细胞数量;下调凋亡相关基因Bax、caspas-3,上调Bc1-2,Bcl-2/Bax比值升高;抑制P53蛋白表达。低聚壳聚糖可能通过抑制P53蛋白表达,影响凋亡相关基因表达,从而抑制凋亡细胞的产生,有效提高受照小鼠存活率。     

^60Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用60Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义.用60Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化.结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系.5Gy剂量60Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低.PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要.     

小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋亡之间的关系

探讨细胞凋亡在小鼠脾脏辐射损伤与重建中的作用及其机制,为急性放射病的防治提供依据.用原位末端标记、DNA电泳和免疫组化技术观察经2～8Gy不同剂量γ射线整体照射后,小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的动态变化过程和Bax、Bcl-2蛋白在其中的作用.结果表明,(1)照射后早期淋巴细胞凋亡率迅速增加,如6Gy照射后4h和1d凋亡率分别为对照值的4.9和9.7倍;凋亡率还随照射剂量的增加而迅速升高,照射后8h当照射剂量为2、4、6、8Gy时,凋亡率分别为对照值的3.7、5.4、6.2和8.3倍.(2)透射电镜观察表明,6Gyγ-线照射后,小鼠脾脏淋巴细胞出现早、中、晚期典型凋亡细胞的形态学特征.DNA凝胶电泳显示6Gy照射后4和6h,脾脏淋巴细胞出现特征的DNA梯形谱;末端标记法显示6Gy照射后4h凋亡率约为照前值的3.4倍.(3)照射后Bax、Bcl-2蛋白的异常表达证实两者在淋巴细胞凋亡的调控中起重要作用.细胞凋亡参与了小鼠脾脏辐射损伤与修复的全过程,Bax和Bcl-2蛋白对淋巴细胞凋亡的调控起重要作用.     

不同剂量X射线照射对小鼠胸腺、脾脏、肝脏细胞凋亡及p53基因表达的影响

采用X射线全身照射小鼠，在普通光镜及流式细胞仪（FCM）下检测细胞凋亡，用免疫组织化学方法检测p53蛋白的表达。结果表明，照射剂量在2-8Gy范围内，脾脏、胸腺细胞凋亡率随照射剂量的增加而升高，细胞周期阻滞于G1期，凋亡率最高在照后8-12小时。肝脏细胞凋亡率最高峰出现在照后24小时，S期和G2／M期细胞阻滞增多。脾脏、胸腺细胞中p53蛋白表达阳性，肝脏细胞中p53蛋白表达阴性。     

~(60)Coγ射线照射人血淋巴细胞诱导p53相关基因mRNA表达水平的变化

采用不同剂量(0~10 Gy)60Coγ射线照射人外周血淋巴细胞,通过抽提mRNA,采用real-timePCR检测不同剂量照射后淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。筛选出最佳照射剂量(5 Gy)后,用该最佳照射剂量照射淋巴细胞,检测不同时间点(0~72 h)淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。结果表明,淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平随照射剂量的增加而增加,并呈现出剂量效应关系。在5 Gy最佳剂量照射后,淋巴细胞GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8 h时达到最高,随后开始逐渐降低;淋巴细胞CDKN1A基因mRNA表达水平随时间的推移未见明显变化趋势。淋巴细胞系中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平与照射剂量均有较好的剂量效应关系,两者均有可能作为电离辐射的生物剂量计来估算受照剂量水平。     

低聚壳聚糖与银杏叶聚戊烯醇配伍对辐射损伤小鼠微核率及p53、Gadd45蛋白表达的影响

以低聚壳聚糖与不同浓度的银杏叶聚戊烯醇配伍,研究了其对受照小鼠30天存活率、存活时间、骨髓微核及脾脏p53、Gadd45蛋白的影响。结果表明,300 mg/kg低聚壳聚糖与5 mg/mg银杏叶聚戊烯醇配伍后能有效提高辐射损伤动物存活率和存活时间,降低损伤动物的微核率以及p53、Gadd45蛋白表达。说明低聚壳聚糖与银杏叶聚戊烯醇配伍具有一定的辐射损伤保护作用。     

电离辐射对小鼠胸腺细胞和脾细胞P53基因mRNA和蛋白表达的影响

采用流式细胞术和Northern blot法检测了不同剂量X射线全身照射后,小鼠胸腺细胞和脾细胞中p53基因mRNA和蛋白表达的变化。结果表明,2．0GyX射线全身照射后,小鼠胸腺细胞p53阳性细胞百分数与对照相比,在照后1h开始升高,8h达最高,以后逐渐下降。不同剂量X射线照射后,小鼠胸腺细胞和脾细胞中p53基因mRNA水平的观测结果表明,75mGy及2.0Gy全身照射后1-48h,小鼠胸腺细胞和脾细胞中p53mRNA水平均未见明显的变化;0.5-6.0GyX射线全身照射后4h,小鼠胸腺细胞和脾细胞中p53 mRNA水平亦未见明显的改变。结果提示,X射线全身照射可诱导小鼠淋巴细胞p53蛋白表达,其p53蛋白表达增加是通过转录后机制实现的。     

X射线诱导人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因表达上调

应用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,定量分析不同剂量X射线体外照射对人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因表达的影响,探讨了运用mRNA水平变化作为电离辐射生物剂量计的可能性。结果表明:经1、2、3、5Gy X射线照射后24h,GADD45和p21基因表达均明显上调。GADD45基因表达在1-5Gy照射剂量范围内呈指数相关。p21基因表达在1-3Gy照射剂量范围内呈线性剂量效应关系,但5.0Gy照射后,其表达不再继续增加。结果表明,X射线照射后人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因的表达在一定剂量范围内呈剂量依赖性上调,GADD45更适合发展为核事故受照射人员的分子生物剂量计。     

电离辐射诱导小鼠骨髓树突状免疫细胞急性凋亡的研究

观察X射线辐射对小鼠骨髓树突状免疫细胞(Dendritic Cells,DCs)的影响。利用X射线对小鼠骨髓树突状免疫细胞进行不同剂量的照射,流式细胞术检测小鼠骨髓DCs的凋亡比例、CCK-8方法检测DCs免疫能力的变化情况,利用蛋白抑制剂对JAK2/STAT3信号转导通路进行抑制,探讨可能的分子机理。与未照射组比较,X射线照射0.5 Gy能够诱导小鼠骨髓DCs抗原递呈和抑制肿瘤细胞活性能力下降,凋亡比例增加,JAK2、STAT和Caspase-3蛋白表达显著增加。X射线能够诱导小鼠骨髓DCs凋亡增加,从而导致细胞免疫能力下降,JAK2/STAT3/Caspase-3通路可能是参与X射线诱导DCs凋亡的机制之一。     

抗辐射球菌pprI基因活体电转染救治小鼠γ射线损伤的实验研究

为研究抗辐射球菌pprI基因活体电转染对哺乳动物急性放射损伤的影响,探讨一种新的救治放射损伤的转基因技术。将自行构建的pCMV-HA-pprI质粒注入接受γ射线照射的小鼠肌肉内,采用活体基因电转导技术将该基因导入细胞内,观察照后第1、7、14、28和35天小鼠死亡率、血细胞计数以及骨髓细胞、脾脏和胸腺淋巴细胞凋亡的变化。结果显示,6Gyγ射线可引起小鼠急性致死性放射损伤,转基因组小鼠死亡率(1/10)明显低于单纯照射组小鼠死亡率(4/10)。与单纯照射组和空载体转染组比较,pprI基因转染组小鼠外周血白细胞总数及红细胞总数于照后第7天显著增高(p0.05);血小板数于第7、14天显著增高(p0.05);血淋巴细胞百分率于照后35天恢复正常;pprI基因转染组脾细胞凋亡率于第7、14、28天显著降低(p0.05);胸腺细胞凋亡率于第1、7、14、35天显著降低(p0.05);骨髓细胞凋亡率于第1、7、14和28天显著降低(p0.05),并且胸腺细胞和骨髓细胞凋亡率均于照后28天恢复正常。结果表明,抗辐射菌pprI基因活体电转染对动物急性致死性放射损伤具有明显的防治作用。     

^60Co辐射对SX1近交系小鼠和昆明种小鼠毒性的比较

SX1近交系小鼠是由昆明种小鼠经过连续的全同胞兄妹交配得到的品种,本试验观察并比较了SX1近交系小鼠和昆明种小鼠对^60Co的辐射毒性,指标包括LD50/30、外周血白细胞数、骨髓有核细胞数、骨髓细胞DNA含量和脾脏结节数。结果表明：与昆明种小鼠相比,SX1近交系小鼠的LD50/30较低,对^60Coγ射线较敏感;外周血白细胞数变化趋势基本相同;骨髓有核细胞数和骨髓细胞DNA含量下降幅度大,并且恢复慢。结果提示,^60Co辐射对SX1近交系小鼠的毒性高于昆明种小鼠。     

耐辐射球菌PprI蛋白对急性放射损伤小鼠防护作用的初步研究

研究耐辐射球菌PprI蛋白对哺乳动物急性放射损伤的防护作用,初步探讨其作为一种新的抗辐射蛋白的作用机制。将PprI蛋白或生理盐水注射入小鼠肌肉内,观察辐照后第1、7、14、28天小鼠外周血象以及小鼠骨髓、胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡情况。研究结果表明：与生理盐水注射组相比,PprI蛋白注射组外周血白细胞计数于照后第28天显著增高（p〈0．05）;外周血小板数和淋巴细胞百分率于照后第1、7天显著增高（p〈O．05）;PprI蛋白注射组脾脏淋巴细胞凋亡率在照后第1、7、14天明显降低（p〈0．05）;胸腺淋巴细胞凋亡率于照后第14和28天明显降低（p〈0．05）;骨髓细胞凋亡率在照后第1、14和28天明显降低（p〈0．05）;并且骨髓细胞凋亡率于照后第28天基本恢复正常。上述结果初步表明,耐辐射球菌PprI蛋白对哺乳动物急性放射损伤有着明显的防护作用。     

电离辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G1期阻党政军及相关蛋白的表达

探讨X射线诱导EL－4细胞G1期阻滞及相关蛋白的表达。采用PI荧光标记 ,流式细胞术检测细胞周期的变化。用单克隆抗体免疫荧光标记,流式细胞术检测蛋白表达的变化。结果表明,2．0Gy和4.0Gy照射后12-72h,G1期EL－4细胞百分数显著高于假照射组（P＜0．05－p＜0.001).4.0Gy照射后EL-4细胞p53蛋白表达从照射后2h开始明显增高,持续至照射后24h(p＜0．05－p＜0．001）;p21蛋白表达在照射后2h开始明显增高,持续至照射后48h(p＜0.05-p＜0.001);GADD45蛋白表达在照射后2h开始明显增高,持续至照射后48h(p＜0．05－p＜－0．001）;MDM2蛋白表达在照射后4h开始明显增高,持续至照射后24h（p＜0.05-p＜0.01）。结果提示,中等剂量X射线照射可诱导EL－4细胞G1期阻滞。p53、p21和GADD45蛋白表达在电离辐射诱导EL－4细胞G1期阻滞中起重要作用。     

电离辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G_1期阻滞及相关蛋白的表达

探讨X射线诱导EL 1细胞G1期阻滞及相关蛋白的表达。采用PI荧光标记 ,流式细胞术检测细胞周期的变化。用单克隆抗体免疫荧光标记 ,流式细胞术检测蛋白表达的变化。结果表明 ,2 0Gy和 4 0Gy照射后 12 72h ,G1期EL 4细胞百分数显著高于假照射组 ( p <0 0 5- p <0 0 0 1)。 4 0Gy照射后EL 4细胞 p53蛋白表达从照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后2 4h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;p2 1蛋白表达在照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后 4 8h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;GADD4 5蛋白表达在照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后 4 8h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;MDM 2蛋白表达在照射后 4h开始明显增高 ,持续至照射后 2 4h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1)。结果提示 ,中等剂量X射线照射可诱导EL 4细胞G1期阻滞。p53、p2 1和GADD4 5蛋白表达在电离辐射诱导EL 4细胞G1期阻滞中起重要作用     

p53及其下游基因在电离辐射诱导小鼠胸腺细胞G1期阻滞中的作用

采用流式细胞术和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测了Ｘ射线全身照射后的昆明系小白鼠胸腺细胞的细胞周期、ｐ５３及其下游基因表达的变化。结果表明：⑴２ＧｙＸ射线全身照射后４ｈ，小鼠胸腺细胞Ｇ１期细胞百分数明显高于假照射组，２４ｈ达峰值，持续至照射后４８ｈ；⑵２Ｇｙ照射后ｐ５３蛋白表达在照射后１～８ｈ明显增高，ｐ２１蛋白表达在照射后４～４８ｈ明显增高，而ＧＡＤＤ４５蛋白表达示未南明显变化；⑶２ＧｙＸ射线照射     

神经肽P物质对放射损伤皮肤成纤维细胞周期及凋亡的影响

为探讨神经肽P物质(substance P,SP)对放射损伤皮肤成纤维细胞凋亡及周期的影响,将人皮肤成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF-1)分为0 Gy组(对照组)和12 Gy组、18 Gy组、12 Gy+SP组、18 Gy+SP组4个实验组。实验组经12 Gy、18 Gy的电子束照射,其中12 Gy+SP组、18 Gy+SP组于照射前1 h给予10^-7 mol/L SP干预。照射后48 h,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax表达情况。细胞周期检测显示,与0 Gy组相比,12 Gy和18 Gy组细胞G₂期百分比显著增加;18 Gy+SP组与18 Gy组相比,细胞G₂期百分比显著降低。细胞凋亡检测显示,与0 Gy组相比,12 Gy和18 Gy组细胞凋亡率显著升高;SP干预组(12 Gy+SP组、18 Gy+SP组)较照射组(12 Gy组、18 Gy组)的细胞凋亡率显著降低。实时荧光定量PCR对Bcl-2和Bax表达检测显示,与0 Gy组相比,12 Gy和18 Gy照射组细胞Bax基因表达显著升高,Bcl-2基因表达显著降低;SP干预组(12 Gy+SP组、18 Gy+SP组)较照射组(12 Gy组、18 Gy组),Bcl-2基因表达显著升高,Bax基因表达差异不显著。上述结果揭示,电子束照射可诱发人皮肤成纤维细胞的凋亡及细胞G₂期阻滞;SP可抑制放射损伤人皮肤成纤维细胞的凋亡及G₂期阻滞。     

胎肝-骨髓程序移植提高移植效果

为进一步提高骨髓移植效果。以昆明种小鼠急性放射病为模型,进行了胎肝－骨髓程序移植（ＦＬ－ＢＭＳＴ）后小鼠活存及造血重建、急性移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）的研究。胎肝－骨髓程序移植 １ｘ １０６个骨髓细胞时,于照射后第 １７ｄ外周血白细胞、骨髓有核细胞计数接近正常,ＣＦＵ－Ｅ、 ＣＦＵ－ＧＭ、 ＣＦＵ－Ｆ、 ＣＦＵ－Ｓ已达正常; ＧＶＨＤ较一次骨髓移植组轻;活存率达６０％,显著高于一次骨髓移植组。胎肝-骨髓程序移植既充分利用了每次腾出的“龛位”（Ｎｉｃｈｅ）,又通过移植胎肝基质细胞改善了“龛位”,增加了“龛位”,从而增加了干、祖细胞的植入并加快增殖分化,减少了移植细胞数,提高了移植效果;是一种较好的移植新方法。     

电离辐射诱导BALB/c小鼠骨髓细胞基因表达谱的研究

利用基因芯片技术研究了辐射后小鼠骨髓细胞基因表达谱的变化。结果发现在芯片上8079个基因中，有660个基因的表达有明显差异，其中354个基因的表达量增高，306个基因的表达量下降。在差异基因中功能或部分功能已知基因有222个，对其中差异2．5倍以上基因进行分析，发现表达差异基因涉及细胞凋亡、细胞周期、信号转导、免疫与应激、核酸合成、转运蛋白与通道蛋白等多个方面，其中以信号转导和免疫应激相关基因所占比例较多，反映出辐射对细胞损伤的多靶点、多层次及多通路的特点，深入研究这些辐射相关基因在造血辐射损伤中的作用，可为放射病治疗、肿瘤放疗提供新的靶点和方法。