PCR-DGGE技术用于石油污染土壤中微生物群落结构多样性的初步研究

 摘要：采用现代分子生物学技术,结合传统的富集培养过程,直接从土壤中提取细菌总DNA和从培养基富集培养的菌体中提取总DNA,并对基因组总DNA中16S rDNA V3可变区进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定,对油田某区块石油污染土样微生物群落和多样性进行初步研究。结果表明,年代较久的石油重度污染土壤菌群数量少于轻度污染土壤,经人工堆肥处理的土壤生物多样性明显优于未进行人工处理的污染土壤;经堆肥处理的土壤中微生物多样性在纵向上也存在差异,中层土微生物多样性明显,表层土最不明显;不同污染土壤中存在一定数量相同的优势菌群,但也表现了相当的差异性,经堆肥处理的污染土壤中微生物群落组成的相似性在纵向上也存在差异。     

胜利油田单12区块内源微生物分子生态研究

为了全面客观地了解油藏内源微生物生态变化规律,针对油藏微生物特点建立了基于PCR扩增的变性梯度凝胶电泳(DGGE)和末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)2种研究方法。提取胜利油田单12区块注入水和产出水中微生物的总DNA,并以此DNA为模板PCR扩增16S rDNA,然后分别进行DGGE和T-RFLP分析。DGGE分析结果:注入水和单12-4井检测到的条带数各有10条,单12-5井有7条,但是单12-4井、单12-5井优势种群条带数都有6条,大于注入水的4条,表明油藏内源微生物具有十分丰富的多样性,激活剂的注入激活了内源微生物;T-RFLP分析表明,该区块油藏中主要存在脱硫弧菌、假单胞菌、不动杆菌和梭菌等细菌,这些均为有益采油菌类。该研究从分子生态学角度更准确地掌握了油藏微生物生态变化规律,为内源微生物驱油方案的优化和驱油效果的提高起到跟踪指导作用。     

营养注入后油藏微生物群落16S rRNA基因的T-RFLP对比分析

为了监测油藏微生物群落动态，应用不依赖微生物培养与克隆的T-RFLP方法研究了模拟油藏环境中营养物的注入对油藏微生物群落结构的影响。以基因组总DNA为模板，用细菌和古菌的荧光标记引物对16SrRNA基因进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶RsaⅠ和MspⅠ消化，用毛细管凝胶电泳分离酶切产物后利用LIFD检测器精确检测T-RFs，以确定每个片断的长度和丰度。不同时期微生物群落的T—RFLP对比分析表明，营养物注入后，T—RF的数量与丰度都有显著提高，且不同时期呈现出不同的群落结构。在内源微生物驱油研究中，T—RFLP方法是跟踪油藏微生物群落动态和对比分析群落结构的有效方法。图2表2参14     

T-RFLP微生物监测技术及矿场应用研究

运用基于聚合酶链式反应的分子生态学监测技术,分离和纯化了油藏产出液中微生物的总DNA,以纯化的DNA样品为模版扩增出代表油藏微生物种群特征的。16SrDNA,然后进行基因末端限制性片断长度多态性的分析,建立了分子水平的油藏微生物监测方法,为微生物驱矿场试验中注入功能菌的跟踪分析提供了快速、简便、可靠的监测手段。文章介绍了T-RFLP微生物监测技术在罗家油田罗801块微生物驱油现场试验中的应用情况。     

DNA检测技术及其在微生物采油中的应用

专题论文。第一节简述了聚合酶链式反应(PCR)技术的特点、原理及在微生物采油中的作用。第二节介绍了菌种16S rRNA基因碱基序列分析的操作程序，包括基因扩增及精翻、16S rRNA基因克隆、荧光标识基因序列PCR扩增、基因碱基序列及微生物属种确定，给出了2个MEOR菌的基因碱基序列及属种。第三节介绍了多酶切和混合酶切两种PCR．RFLP基因检测技术(RFLP：限制性片段长度多态性)，后一种方法使操作减少l／4。第四节介绍了直接DNA扩增基因检测技术，包括平板菌落法(检测时间2d)和最大可能数法(当天得检测结果)，DNA模板制备及其反应体系，电泳法检测及菌种检出。第五节介绍了DNA基因检测技术在吉林油田多项微生物采油矿场试验中的应用，包括常在菌对微生物采油影响分析．微生物单井吞吐、微生物清防蜡、微生物调驱效果分析，多功能案采油菌构建的实验探索。图2参9。     

利用分子生物学技术分析生物气藏中甲烷形成途径

针对松辽盆地阿拉新气田杜6-3井、敖南气田敖-7井地层水样品,以基因组总DNA为模板,用细菌和古茵的引物对16S rDNA基因进行聚合酶切反应扩增、基因转化和测序;基于基因序列信息,构建气藏中微生物细菌、古菌克隆文库,绘制本源微生物细菌、古菌系统发育树,分析微生物群落结构,推测甲烷合成的可能途径。结果表明,杜6-3井和敖-7井样品中微生物种类较少,细菌文库中绝对优势微生物为假单胞菌属微生物,古菌文库中绝对优势微生物为甲烷杆菌属微生物。适宜的条件下,杜6-3井和敖-7井中的微生物菌群均具备利用CO2转化为甲烷的潜力。杜6-3井菌群产甲烷途径推测主要为CO2还原途径,不能完全排除有少量乙酸发酵产甲烷的可能性;敖-7井样品中,甲烷微生物合成途径明确为CO2还原途径。     

微生物驱产出液群落结构与现场生产动态的关系

利用末端标记限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术,对胜利油田微生物驱油先导试验现场的油藏微生物群落结构进行了跟踪分析。监测数据包括试验区的注入水和4口受效油井。通过多样性指数计算和聚类分析,在时间上和空间上分别比较了油井产出液的微生物群落结构,并且重点分析了其与油井生产动态的关系。结果表明,不同油井、不同时间的群落结构相似性高度一致。这种相似性与油藏代谢产物乙酸变化的一致性说明:微生物群落分析能够很好地反映油藏微生物变化的真实情况;微生物驱油工艺的实施能够促进内源微生物群落多样性的改变,油藏微生物多样性与油井产量在整体上呈负相关。微生物群落结构分析为微生物驱油现场油井受效评价提供了潜在的依据。     

油田水中细菌群落分析

油田水中细菌群落分析，对于外源性和内源性微生物采油技术的研究和开发都是必要的。介绍了油田水中常见的7类细菌对微生物采油的有益和有害作用。采用三管平行MPN或绝迹稀释法和浇注平板法对胜利油田S12块回注污水和5口油井产出水中有益菌(石油烃降解菌HDB，脱氮菌DNB，产甲烷菌MPB)和有害菌(硫酸盐还原菌SRB，铁细菌IB，硫细菌SB，腐生菌TGB)群落进行了计数分析，求得了最大可能含菌量，结果表明胜利S12块油藏内源微生物群落较丰富，3种有益菌和4种有害菌普遍存在，在各水样中各类菌的含量有所不同，含量总体较低。认为S12块油藏可以注入合适的营养物质，选择性地激活微生物采油有益菌，抑制有害菌，提高油藏采收率。表2参21。     

石油污染土壤中细菌群落结构特征

 采用聚合酶链式反应(PCR)技术与变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,解析了石油污染土壤中细菌群落结构特征。结果表明,在总石油烃的含量高于30mg/g(以干土计)的重度污染区域,井距相同的土样中的细菌群落表现出对石油污染胁迫较为一致的响应,某些乳球菌(Lactococcus sp.)和无色细菌(Achromobacter sp.)等细菌相对数量显著增加,可以判断其对石油烃的降解起着重要作用。通过对细菌群落结构的解析,可以为石油污染土壤的微生物修复提供理论依据。     

内源微生物提高采收率实验研究

为了探讨在胜利油田沾3区块注入以玉米浆为主的营养物刺激内源微生物生长和繁殖从而提高采收率的可行性，用MPN法对油藏内源微生物的群落组成进行了分析，并在模拟油藏条件下进行了内源微生物培养实验和岩心驱替实验。结果表明，腐生菌、烃类氧化菌、发酵菌等是油藏中存在的主要微生物群落；注入玉米浆可以有效刺激内源微生物的生长与代谢，产生表面活性剂和生物气，有利于驱油；硝酸铵可以有效抑制硫酸盐还原菌的生长。向岩心注入0．4PV的营养物，玉米浆浓度10～20mL／L，并关闭培养10～20d后，采收率提高约8％。实验证明，利用内源微生物提高沾3区块采收率是可行的。     

Characterization of the predominant spoilage bacteria in sliced vacuum-packed cooked ham based on 16S rDNA-DGGE

16S rDNA DGGE fingerprinting and phylogenetic analysis were used to reveal the dynamics and identification of the predominant spoilage bacterial in sliced vacuum-packed cooked ham during storage at 4 °C. Total bacteria DNA was directly extracted from the ham. Simultaneously, culture methods were performed. The Nest PCR and touchdown protocol were applied to amplify the V3 region of the 16S rDNA. By analysis of the community dynamic directly obtained from the DGGE profiles, the predominant spoilage bacteria were found to be Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus and minor components were members of the genus Leuconostoc (Leuconostoc mesenteroides and uncultured Leuconostoc).     

Study of the microbial diversity of Oreochromis niloticus of three lakes of Cameroon by PCR-DGGE: Application to the determination of the geographical origin

The new European regulation 178/2002 imposes the determination of the geographical origin in the traceability process of the foodstuffs at the moment of commercial transactions. In practice, it is difficult to determine with accuracy the geographical origin of foodstuffs. For this purpose, the total analysis of the bacterial communities in samples is used. In the present study the molecular technique using 16S rDNA profiles generated by PCR-DGGE was used in order to detect the variation in bacterial community structures of Tilapia fish from three different lakes of the north of Cameroon and the effect of the season and fish species on these bacteria profiles. The V3 region of bacterial rDNA from fish was amplified by PCR and was analyzed by DGGE. When the 16S rDNA profiles were analysed by multivariate analysis, distinct microbial communities were detected. The bands profiles obtained from different lakes were different and specific for each location and could be used as a bar code to certify the origin of the fish. The fish specie did not have an influence on microbial profiles of fish contrarily to the season.     

Determination of speciality food salt origin by using 16S rDNA fingerprinting of bacterial communities by PCR–DGGE: An application on marine salts produced in solar salterns from the French Atlantic Ocean

The determination of geographical origin is part of the demand of the traceability system of food products. A hypothesis of tracing the source of a product is to analyse in a global way the bacterial communities of the food samples after their production. For this purpose, molecular techniques employing 16S rDNA profiles generated by PCR–DGGE were used to detect the variation in bacterial community structures of salts from four French regions. When the 16S rDNA profiles were analysed by multivariate analysis, distinct microbial communities were detected. The band profiles of the salt bacteria from different producing areas were different and were specific for each location and could be used as a bar code to certify the origin of salts. These band profiles can be used as specific markers for a specific location. This method is proposed as a new traceability tool which provides salts with a unique bar code that permits to trace back salts from store shelves to their original location.     

动态驱替内源微生物生长代谢与驱油效率关系

油藏内源微生物的生长代谢活性直接影响内源微生物驱油技术现场实施效果,摇瓶培养及一维物理模拟实验手段无法真实模拟微生物动态驱替过程。利用三维物理模拟实验体系,开展了内源微生物驱油过程中内源微生物群落生长代谢规律研究。研究结果表明：由于多孔介质对激活剂的滞留和吸附作用,三维模拟动态驱替体系中内源微生物群落激活剂消耗C∶N∶P比传统微生物培养的比例低,而且不同生长阶段的组分消耗比例不同;模拟油藏环境的动态驱替体系中,内源微生物群落生长代谢呈现出与传统微生物培养相似的延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期,但生长周期明显延长。内源微生物群落生长代谢规律与生产动态之间存在明显的对应关系,生长延滞期含水无明显变化,对数生长和稳定期含水快速降低,进入衰亡期后驱替效率快速降低,该认识与现场产出液微生物浓度与生产动态变化规律一致。     

聚合物驱后油藏激活内源微生物驱油现场试验

针对聚合物驱后油藏内源微生物的生长特点,对大庆油田萨南开发区南二区东部聚合物驱后典型油藏开展了激活内源微生物驱油现场试验。通过优选由玉米浆干粉、硝酸钠和磷酸氢二铵构成激活剂,与保护剂聚合物交替注入,并运用分子生态学末端限制性片段长度多态性方法分析了内源微生物激活前后群落结构的变化规律,研究了利用内源微生物驱油技术的可行性。现场试验结果表明：聚合物驱后油藏中有明显的产气增压效果;油藏驱动压力的动态变化及代谢产物气体组分CH₄和CO₂的δ¹³C同位素含量波动,验证了激活剂的加入促使油藏内源微生物微氧和无氧代谢交替进行;产出液的各项生化监测指标均有明显变化,激活后优势菌群为Pseudomonas、Thauera和Arcobacter,且丰度增高;试验区阶段累计增油3 068.13 t,含水率下降2.2% ,驱油增产效果明显。该试验的成功实施证明了聚合物驱后油藏采用激活内源微生物驱油的工艺方法是可行的,并为同类油藏进一步提高采收率提供了可借鉴的方法和途径。