纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究

经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶,纯化倍数15.6,回收率10.2%,SDS-PAGE电泳显示为二个组分,分子量在29000左右。对其纤溶性质研究表明:纳豆激酶活性的最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆生理盐水浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

纤溶活性重组纳豆激酶在大肠杆菌中的表达

通过PCR方法扩增纳豆激酶成熟肽和纳豆激酶酶原(proNK)基因片段,并分别克隆到表达载体pET28a上,构建与His标签融合表达的重组表达质粒pET28a-NK和pET28a-proNK,转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和纤维蛋白平板检测目的蛋白的表达及表达产物的纤溶活性.结果表明,纳豆激酶成熟肽基因在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在,表达产物没有纤溶活性;纳豆激酶酶原基因在大肠杆菌中的表达产物能自我剪切,形成有纤溶活性的纳豆激酶,但同时对宿主细胞有降解毒性.     

纳豆激酶纤溶功能及其机理研究

以 2 0 %FeCl3制造兔颈动脉血栓模型 ,并将 18只日本大耳兔 ,随机分为 3组 ,即十二指肠注射NK高、低剂量实验组 (分别为 45 0 0UI/kg、2 5 0 0UI/kg)、生理盐水模型对照组。观察纳豆激酶粗酶液体外、体内溶解血栓的作用。体外试验表明 ,B N 12液体发酵粗酶液作用血凝块 10、2 2h后 ,溶解率分别为 78 2 3%、98 16% ,对照组分别为 2 1 43%、2 3 91% (P<0 0 5 ,P <0 0 1) ;动物试验表明 ,NK高剂量组给药 1、1 5h后 ,CT (P <0 0 5 )、PT (P <0 0 5 )、TT (P <0 0 1)和APTT (P <0 0 5 )均显著延长 ,给药 2h后ELT和Fig含量显著降低(P <0 0 1、P <0 0 5 ) ,FDP含量明显增高 (P <0 0 5 ) ,血浆D dimer呈阳性 ;低剂量组CT、PT和APTT各指标及Fig含量无显著变化 ,但ELT明显缩短 (P <0 0 5 ) ,FDP含量、TT值显著增高 (P <0 0 5 ) ,且血浆D dimer呈阳性。纳豆激酶在体内和体外均具有明显的溶栓效果 ,提高纤溶活性、增强抗凝作用是其溶栓机理之一。     

一种食源性纤溶酶(纳豆激酶)酶学性质的研究

纳豆激酶是一种新型食源性纤溶酶 ,具有易于提取 ,无任何毒副作用 ,溶栓效果好 ,体内作用时间长等特点。实验以新鲜制备纳豆为原料 ,经生理盐水浸提 ,硫酸铵分级盐析 ,SephadexG -10 0层析获得纯纳豆激酶活性蛋白。实验表明 ,该酶分子量为2 80 0 0Da ,等电点为 9,在 6 0℃以下 ,pH 5～ 12均较稳定 ,其最适反应pH为 8,最适反应温度为 45℃ ,Mg2 和Co2 离子对酶活有激活作用 ,而Cu2 、Zn2 和Al3 等离子对该酶有明显的抑制作用。纳豆激酶酶学性质的研究对开发纳豆激酶成为新型溶栓制剂具有重要的实践意义     

紫外分光光度法测定纳豆激酶体外纤溶活力

建立短时间、定量测定纳豆激酶体外纤溶活力的方法。在体外反应体系中制备血纤维蛋白底物,向体系中加入待测样品(纳豆激酶),进行纤溶反应。用紫外分光光度计测定纳豆激酶水解纤维蛋白后生成的可溶性产物的吸光值。由此对纳豆激酶体外纤溶活性进行定量测定并进行方法可行性分析。该方法具有较好的灵敏度、精密度和准确度,用时短,该方法适用于纳豆激酶体外纤溶活性的定量分析。     

高纤溶活性纳豆食品的研究

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,我们从酱豆、豆豉及纳豆中分离和筛选到5株有明显纤溶活性的芽孢菌株,其中NK-5菌株活性最高,故被用作纤溶活性纳豆生产菌。根据形态和生理生化特征以及DNA中G C含量,鉴定NK-5菌株为枯草杆菌(Bacillus substilis),该菌株的重要特点是产生强力纤溶酶和大量胞外粘质。后者经鉴定为r-多聚谷氨酸。用NK-5菌株试制的纳豆既有日本纳豆典型的感官特征和营养组成,还具有很高的纤溶活性,其酶活性在贮存中能保持稳定,故有很高的利用价值,可望开发成新型保健品。     

纳豆激酶稳定性的研究

纳豆激酶是一种新型溶栓酶 ,具有溶栓效率高、药效时间长以及无毒副作用等优点。实验研究了pH、温度、金属离子以及某些有机物质对该酶稳定性的影响。实验表明 ,该酶在 4 5℃以下和 pH 7～ 9范围内酶活相对稳定 ;Mg2 +和Co2 +离子对酶活有激活作用 ,而Cu2 +、Zn2 +和Al3+等离子对该酶有明显的抑制作用 ;牛血清蛋白、蛋白胨、明胶、甘油、丙二醇和海藻酸钠等能显著提高酶的耐热性 ,其中以明胶的作用最为明显。这些发现对液体酶的生产有重要指导作用     

纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究

研究对纳豆激酶和豆豉纤溶酶的酶学性质进行了分析和比较,结果发现,二者最适pH值范围和温度基本一致,分别为pH7.0~9.0、50℃;纤溶酶活性在60℃以上迅速下降;纳豆激酶在pH6.0~10.0、豆豉纤溶酶在pH7.4~12.0时稳定性好;Mg2+对2种酶均有激活作用,Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+有不同程度的抑制作用,Cu2+的对纳豆激酶的有显著抑制作用。     

纳豆纤溶酶--纳豆激酶的分离提纯及稳定性研究

实验采用硫酸铵分步盐析，Sepharose Butyl Fast Flow疏水层析，Sephamse CM Fast Flow离子交换层析和Superdex75凝胶层析，对纳豆浸提液进行分离纯化，得到电泳纯的纳豆激酶。并研究了纳豆激酶的稳定性，实验结果表明，温度对酶活影响显著；pH6—8范围内酶活相对稳定；Zn^2＋、亚硫酸钠对酶活有较大的抑制作用；Al^3＋、Cu^2＋苯甲酸钠对酶也有一定程度的抑制；Mg^2＋、Ca^2＋、甘油、明胶、蔗糖、香精是较好的酶活稳定剂和促进剂。     

纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶发酵工艺控制及纤溶酶分析

基于摇瓶发酵优化结果,在10 L发酵罐中研究了纳豆芽孢杆菌TN-02产纳豆激酶的发酵控制工艺,分析了发酵产物中纤溶酶的组分纯度。在放大发酵过程中,考察了培养温度和主要碳、氮源的流加补充对产酶的影响,并利用卡那霉素抗性基因kan对纳豆芽孢杆菌TN-02中的纳豆激酶基因aprN进行了部分替换和插入失活,获得了aprN突变的重组菌TN-021。结果表明,通过温度的阶段性控制和甘油、胰蛋白胨补料发酵,获得纳豆激酶的最高表达量为13 978.3 U/mL,是摇瓶发酵最高表达量的1.8倍;在菌株TN-021的摇瓶发酵产物中未检测到纤溶酶活力,证明了纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌TN-02发酵产物中唯一纤溶酶。研究结果为纳豆激酶高水平发酵放大工艺控制奠定了基础,同时为纳豆激酶的品质分析方法提供参考。     

不同菌种发酵对纳豆激酶活性及黏液成分影响

采用5株不同来源的纳豆菌JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214,通过纳豆发酵实验,研究不同菌株对纳豆激酶活力、黏液营养物质的影响,评价其发酵性能,为纳豆工业生产用菌筛选提供借鉴。结果表明,菌株JLGZL-018生产的纳豆激酶活性最高,为4 167 IU/g;其生产的纳豆黏液成分中总蛋白、可溶性总糖含量最高,分别为（17.38±0.54）%、（5.21±0.13）%;水解氨基酸总量适中,为（5.24±0.27） g/100 g,7种必需氨基酸含量最高,为（0.87±0.08） g/100 g;游离氨基酸各成分与其他4株菌无显著差别。菌株JLGZL-018综合发酵性能较好,具有开发应用潜力。     

基于纳豆激酶活性的纳豆加工条件的优化研究

为优化纳豆加工工艺条件,以纳豆激酶活性为指标,采用琼脂糖—纤维蛋白平板法,通过单因素实验,确定了纳豆的加工工艺参数为:大豆的浸泡时间15 h,121℃高温蒸煮时间45 min,接种量3%,发酵温度38℃,发酵时间28 h,后熟时间1 d;用响应面分析法对浸泡时间,蒸煮时间、发酵温度这三个影响较显著因素进行优化,最终确定纳豆发酵条件:浸泡时间15 h,蒸煮时间51 min,发酵温度37.5℃。优化后纳豆激酶活性达2493.33 U/g。      

纳豆激酶最新研究进展

纳豆激酶来源于日本的传统食品——纳豆,是一种具有强烈溶栓作用的蛋白激酶。对纳豆激酶的结构和生化特性进行了论述,并且通过介绍纳豆激酶基因工程和国内外纳豆激酶相关产品的开发状况,证明纳豆激酶具有广阔的市场应用前景。     

高NK活性纳豆菌的诱变选育及产酶条件的研究

采用物理化学诱变方法,对纳豆菌进行复合诱变,以期筛选出纳豆激酶(NK)活力高的优良菌株。以实验室分离、筛选的纳豆菌NK-8作为出发菌,通过紫外线和氯化锂对其进行复合诱变,经过菌种的初筛和复筛,得到了酶活较出发菌提高2.2倍的菌株JN-14,并对初始菌株与诱变菌株进行了一系列的比较。实验进一步研究了该菌株产纳豆激酶的发酵过程,比较了不同的营养源与生长条件对菌株产酶的影响,优化、确定了菌株产纳豆激酶的产酶条件。     

纳豆发酵及后处理生产工艺对纳豆激酶活性的影响

跟踪了纳豆发酵过程中纳豆激酶的变化.考察了纳豆冻干粉在模拟胃肠环境、冷冻干燥以及破碎过程中的酶活损失情况,为纳豆胶囊生产过程中工艺确立、剂型选择和食用方法提供了技术基础.     

纳豆菌分离、鉴定及纳豆激酶高产菌株的正向选育

从日本纳豆食品中分离到1株枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)Bs01-1菌株,根据纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶与蛋白酶活性的正相关关系,采用紫外线直接照射涂菌蛋白平板进行诱变育种的,成功地筛选到2株突变株MBS04-6和MBS04-9,其溶纤活性分别比出发菌株提高了87%和69%,达到4 179 IU/mL和3788 IU/mL。该法筛选菌株的正向突变率达到10%。     

富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶的发酵工艺研究

该研究以富含纳豆激酶（NK）的纳豆豆浆和复原乳为主要原料,研制富含NK的抹茶纳豆酸奶。分别探究纳豆豆浆、白砂糖、抹茶粉添加量、乳酸菌接种量对富含NK抹茶纳豆酸奶感官评分的影响,采用正交试验优化富含NK抹茶纳豆酸奶发酵工艺,并对富含NK抹茶纳豆酸奶的品质进行评价。结果表明,富含NK抹茶纳豆酸奶最适发酵工艺条件为：纳豆豆浆添加量6%,白砂糖添加量8%,抹茶粉添加量0.7%,乳酸菌接种量0.3%。在此优化条件下,酸奶的感官评分为88.6分,脂肪、蛋白质、非脂乳固体含量、酸度、NK活性及乳酸菌数分别为3.15 g/100 g、3.08 g/100 g、8.25 g/100 g、82 °T、688.6 U/mL、5.8×108 CFU/mL。其各品质指标均符合国标GB 19302—2010《发酵乳》要求,且具有一定的保健功能。     

中式纳豆制备技术的研究

为探索出符合中国人口味且纳豆激酶酶活力高的中式纳豆加工技术,该研究从市售的4种纳豆中分离出4株纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）,并筛选出一株产纳豆激酶能力最强的菌株NK3。以牛奶培养基替代传统的种子液培养基培养纳豆菌种,通过单因素试验考察发酵温度、时间、接种量、加水量对纳豆激酶酶活力的影响,采用正交试验优化纳豆发酵条件。结果表明,以牛奶为培养基培养的纳豆菌生长良好,在发酵温度27 ℃、发酵时间1.5 d、接种量5%、加水量6%条件下,菌株NK3发酵制备出的纳豆无氨臭味,有淡淡的奶香味,且纳豆激酶酶活力高达668.5 U/g。     

响应面法优化纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶培养条件

采用单因素试验及响应面试验对纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）培养条件进行优化。在单因素试验的基础上,取影响纳豆激酶活力的5个重要条件因子（培养温度、培养时间、初始pH、接种量、菌龄）设计5因素3水平的响应面试验,建立以纳豆激酶活力为响应值的多元二次回归方程。结果表明,纳豆芽孢杆菌最佳培养条件为：培养温度34℃、培养基初始pH值为7.5、接种量3%、培养时间95 h、菌龄17.5 h。在此最佳条件下,纳豆激酶活力达到5 087 FU/mL,较优化前提高了18.83%。