明串珠菌电转化的优化

为了构建食品级基因工程受体菌,课题对明串珠菌的电转化条件进行了优化.以大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒pCW4为载体,以明串珠菌为受体,文章优化了细胞壁处理方式、电击参数、复苏时间等与电转化相关的因素.结果表明:用氨苄浓度0.7μg/mL的MRS培养基培养明串珠菌至OD600为0.5左右,以PBS作缓冲液,收获制成感受态细胞,与1μg DNA混合,在电场强度12 kV/cm、电阻200 Ω、电容25μF下电击转化,以含80 mmol/L MgCl2的MRS培养基复苏培养3h,得到最高的转化效率为1.75×105 cfu/μg DNA.     

嗜碱芽孢杆菌电转化方法的优化

优化了嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)TCCC11263的电转化条件,电转化条件包括细胞生长状态、电击场强、电击缓冲液组成、质粒DNA浓度.建立了一种适用于B.alcalophilus TCCC11263的电转化体系.结果为:B alcalophilus TCCC11263培养至OD600为1.0时,电转化效率最高,DNA的转化子数达0.14×103个转化子/μg:用含0.5mol梨醇、0.5mol甘露醇、10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞,在场强21kV/cm、电阻200Ω,电容25μF的电击条件下,加入0.7μg质粒DNA,电转化效率达到1.5×103个转化子/μg DNA.     

产甘油假丝酵母两种转化方法的比较

为了研究产甘油假丝酵母高产甘油和耐高渗的机制,以Zeocin作为选择标记,考察和比较了两种转化方法,即醋酸锂法和电转化法的转化效果,以建立简单有效的产甘油假丝酵母转化体系。结果表明,细胞生长时期是影响转化率的关键因素。在OD600约为1.3时制备感受态细胞,在电压为1.5 kV时进行电击,可获得较高转化率,为每微克DNA 139个转化子。在OD600约为1.0时制备感受态细胞,醋酸锂预处理细胞1 h,获得的转化率为每微克DNA 154个转化子。综合考虑,醋酸锂法更适合于产甘油假丝酵母的转化。     

食品微生物肉葡萄球菌的高效转化技术研究

肉葡萄球菌是广泛应用于发酵肉制品的食品微生物,然而,该菌在发酵制品中的生长代谢机理目前尚未可知,究其原因与基因工程操作中质粒转化难、无法建立成熟的分子生物学体系密切相关。肉葡萄球菌具有厚且致密的刚性细胞壁和限制性修饰(RM)系统,导致电转化的再现性差、效率低。本试验研究了电击缓冲液、电场强度、质粒质量浓度、复苏培养基以及质粒修饰和感受态细胞的高温热处理对肉葡萄球菌pCA44电转化效率的影响,并进行电转方案优化。结果表明:用10%甘油与0.5 mol/L甘露醇洗涤制备感受态细胞,加入500 ng/100 μL经大肠杆菌DC10B修饰的质粒,56 ℃高温热处理肉葡萄球菌pCA44感受态细胞2 min后,在电场强度10 kV/cm的条件下电击质粒与细胞混合物,且电击结束后立即加入含有0.5 mol/L甘露醇的复苏培养基RGM2,得到的肉葡萄球菌pCA44电转化效率最高,达到6.26×105 CFU/μg,且随机挑取转化子进行PCR验证均是阳性。本研究获得的电转方案显著提高了肉葡萄球菌pCA44电击转化效率,可为其发酵代谢机制解析提供技术支持,并为后续其它含有RM系统屏障的葡萄球菌系菌株提供参考。     

电转化法制备高转化效率的E.coli感受态细胞研究

为了制备高转化效率的E.coli TG1和E.coli DH5α感受态细胞,采用电转化方法探索E.coli生长对数期的不同生长阶段、质粒DNA含量、电场强度对E.coli转化效率的影响.研究结果表明40 μL菌液中加1.0 ng pUC19 DNA,用间隙0.2 am电击杯时转化效率最高,E.coli TG1有1个电转化效率峰值,即A600为0.665时,转化效率达1.7×109cfu/μg pUC19 DNA;E.coli DH5α有2个转化效率峰值,即A600为0.443和0.810时,转化效率均为3.0×109cfu/μg pUC19DNA.研究结果表明,在相同情况下E.coli DH5α的转化效率高于E.coliTG1,利用本实验确定的参数可制备出高转化效率的电转化感受态细胞.     

不同感受态细胞制备方法对副干酪乳杆菌转化效率的影响

目的:研究不同感受态细胞制备方法对副干酪乳杆菌转化效率的影响。方法:优化并比较未处理、青霉素处理法、溶菌酶处理法及NaCl处理法制备的感受态细胞的转化效果。结果:优化各处理法获得的条件分别为:未处理法OD600为0.8,甘氨酸质量浓度为3 g/mL,青霉素终质量浓度为12.5μg/mL,溶菌酶质量浓度为10 mg/mL,NaCl浓度为0.7 mol/L。不同处理方法获得的感受态细胞转化效率差异显著(P0.05),转化效率由高到低依次为青霉素处理法【(1.64±0.05)×103cfu/μg质粒】、甘氨酸处理法【(1.51±0.03)×103 cfu/μg质粒】、NaCl处理法【(1.20±0.04)×103cfu/μg质粒】、溶酶菌处理法【(0.56±0.02)×103 cfu/μg质粒】、未处理法【(0.43±0.01)×103 cfu/μg质粒】。结论:青霉素、甘氨酸及NaCl处理法制备的感受态细胞能够有效提高副干酪乳杆菌转化效率,为副干酪乳杆菌遗传转化体系的建立奠定基础。     

植物乳杆菌G63电转化方法的优化

为获得植物乳杆菌G63高效的电转化方法,本研究从细胞生长状态、细胞弱化剂质量浓度、洗涤液、质粒添加量和电击参数等方面对菌株G63的电转化效率进行优化。结果表明:取菌株G63对数生长中期的细胞制备感受态,以1 g/100 m L甘氨酸作为细胞弱化剂,分别用1 mmol/L Mg Cl2和30 g/100 m L聚乙二醇1000洗涤细胞,并用30 g/100 m L聚乙二醇1000作为电击液,加入20μg穿梭质粒,在1.5 k V和400Ω条件下进行电击,可以获得最高的电转化效率,转化效率达到1.18×103 CFU/μg DNA,满足后续遗传学实验要求。     

利用组成型表达载体pMG36e电转化德式乳杆菌保加利亚亚种的研究

以典型的乳酸菌组成型表达质粒pMG36e为载体,德式乳杆菌保加利亚亚种为受体.采用电转化方法研究受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,以提高电转化效率.结果表明:选择含2.5%甘氨酸的SMRS培养基培养受体细胞至对数中期,收获制成感受态细胞,在电场强度12 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF条件下电击转化,以含20 mmol/L MgCl2、CaCl2的SMRS培养基复苏培养2 h,涂板筛选得到较高的电转化效率.特别是采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率提高30倍以上,达到6.3×104cfu/μg DNA.本研究结果为进一步构建乳酸菌组成型高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株提供试验依据.     

多黏类芽孢杆菌JSa-9电转化方法的优化

为建立多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株的高效电击转化体系,本实验研究菌体培养时间、电场强度、电击缓冲液、质粒用量以及电击后复苏培养时间等因素对JSa-9菌株电转化效率的影响。结果表明:Paenibacillus polymyxa JSa-9培养至OD595 nm为0.3时,电转化效率最高,为0.12×103 CFU/μg DNA;用0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞,在电场强度17.5 kV/cm、电阻200Ω,电容25μF的电击条件下,加入1.0μg/100·mL质粒DNA,复苏培养时间18 h,电转化效率达到约为0.36×103 CFU/μg DNA;制备P.polymyxa JSa-9原生质体,在电场强度5.0 kV/cm的电击条件下,加入0.8μg/100·mL质粒DNA,电转化效率较感受态电转提高到约1.0×103 CFU/μg DNA。     

甲醇毕赤酵母Pichia methanolica的高效电转化方法

采用电穿孔的方法对甲醇毕赤酵母进行外源DNA的转化。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETA-Lip对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。结果表明,当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、质粒DNA浓度为30μg/mL、采用0.2cm电转杯、电压为600 V时,转化率达到最大值,为57个转化子/μg质粒DNA。经抽样鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。为外源基因在甲醇毕赤酵母中的表达奠定了基础。     

抗肿瘤靶向工程菌的高密度发酵及菌粉研制

为获得侵袭性抗肿瘤靶向工程菌株EcNA高菌体浓度的培养基配方，在单因素试验的基础上，通过Plackett-Burman试验筛选出对菌体浓度影响最显著的因素为酵母抽提物、K2HPO4用量，对显著影响因素进行中心组合试验响应面分析。结果表明最佳培养基成分为：可溶性淀粉2?g/L、酵母抽提物50.3?g/L、K2HPO4?14.26?g/L、KH2PO4?3?g/L、MgSO4?0.3?g/L、微量元素母液2?mL/L、接种量3%。发酵后溶液中菌体OD600?nm?达到7.602，菌体生物量达到2.96×109?CFU/mL，比优化前提高了78.3%。以冻干保护剂在冷冻干燥过程中对工程菌株的保护效果为研究对象，通过正交试验得到制成菌粉的最佳保护剂配方为脱脂乳14.25?g/100?mL、蔗糖3?g/100?mL、抗坏血酸钠3?g/100?mL，优化后菌体冻干粉存活率可达86.32%，利于制成延长贮存期的口服菌粉胶囊。     

重组大肠杆菌P84A/MC1061诱导和表达卤醇脱卤酶的条件优化

考察重组工程菌E.coli P84A/MC1061的生长特性,并优化其在卤醇脱卤酶表达过程中的诱导条件和培养条件。在摇瓶发酵中,以阿拉伯糖诱导重组大肠杆菌P84A/MC1061表达卤醇脱卤酶。重点研究培养温度、装液量、摇床转速、培养基初始pH值、诱导时机、诱导剂添加量、诱导剂作用时间对卤醇脱卤酶的表达影响。在培养温度为30℃,装液量为25mL/250mL,摇床转速为200r/min,初始pH值为7.1时,当菌体量OD600值达到2时,按照1‰体积比添加L-阿拉伯糖,诱导培养22h后,发酵液OD值达到21.3,酶活力达到138555.3U/mL。研究发现,培养温度和初始pH值是基因工程菌E.coli P84A/MC1061诱导表达卤醇脱卤酶的显著影响因子,可为卤醇脱卤酶发酵生产的深入研究提供依据。     

渗透压诱导表达重组Clostridium thermosulfurogenes β-淀粉酶基因

以热硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes基因组为模板,PCR扩增出β-淀粉酶基因;将该基因克隆到pET-22b(+)载体上,转入大肠杆菌BL21-SI,采用NaCl形成的高渗透压诱导表达。研究了不同诱导条件对重组菌产β-淀粉酶的影响,结果以菌体密度达到OD600为0.6,诱导剂NaCl浓度为0.6 mol/L,诱导温度为35℃最佳。重组菌以LBON为培养基分批发酵时,由于营养限制,菌体密度OD600仅为4.60,β-淀粉酶活力为118U/mL。采用pH-Stat分批补料发酵时,在菌体密度仅是分批发酵的2.35倍的条件下,得到6.12倍的产酶量,酶活力达722U/mL。重组β-淀粉酶70℃水解可溶性淀粉3h的麦芽糖转化率为62.2%,高于大麦β-淀粉酶的转化率。     

利用his-tag纯化和复性基因工程产物肠激酶

构建了融合表达肠激酶轻链（EKLC）的基因工程大肠杆菌，将该菌于37℃在含30mg／L卡那霉素的LB培养基中培养，当细胞密度（OD600）达到0．5～0．6时加入最终浓度为0．4mmol／L的IPTG并降温至26℃进行诱导表达，4h后目的蛋白质的表达量可达菌体总蛋白质的40％以上，但所表达的重组产物大多以包涵体形式存在于菌体中。利用产物N端携带6个组氨酸标签与金属螯合层析介质中镍离子的亲和性，应用镍离子金属螯和层析对样品包涵体进行了纯化和复性研究。实验结果表明，在变性条件下纯化的样品在柱上不经洗脱，直接用复性液洗涤6h，可以使EKLC在得到提纯的同时实现复性，得到了电泳纯度为96％的具有生物活性的EKLC，最高活性为712U。     

分光光度法快速测定发酵液中杆菌肽效价

建立使用分光光度法测定发酵液中杆菌肽的方法,发酵液经预处理后使用杆菌肽敏感菌(藤黄微球菌)浊度测定杆菌肽效价.藤黄微球菌液体培养3h后,加入待测样品,再培养3h后600nm下测定吸光度,通过杆菌肽浓度与液体培养基浊度之间的线性关系测定杆菌肽效价.此方法检测准确、操作简单,可快速测定发酵液中杆菌肽效价.     

干酪乳杆菌LZ183E高密度培养条件优化

为提高干酪乳杆菌LZ183E在发酵培养液中的菌体密度，首先通过在不同温度下培养菌株，测定48 h内菌液的OD600 nm值并作出生长曲线，得到菌株最适培养温度为37 ℃、接种时间为16 h及收获时间30 h。随后通过单因素试验和正交试验优化，探究不同碳源、氮源、生长因子、初始pH值以及接种量对菌株LZ183E活菌数和OD600 nm值的影响。结果表明，菌株LZ183E的最佳培养条件为葡萄糖25 g/L、酵母膏20 g/L、南瓜汁24 g/L、初始pH 6.5以及接种量2%。此优化条件下，干酪乳杆菌LZ183E的活菌数对数值达到了9.20±0.04，满足高密度培养要求，并且比原始MRS培养基活菌数对数值（8.12±0.06）高出一个数量级，为干酪乳杆菌LZ183E的冻干保护提供了足够的活菌数。     

高密度培养重组E-coli产胆固醇氧化酶的乳糖诱导策略

研究了乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶。结果表明,乳糖不仅可以作为诱导剂诱导外源蛋白的合成,而且能作为碳源促进菌体的生长。通过对诱导条件的优化,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,最高密度达68.9(OD600);在此基础上确定了最佳的诱导时机为发酵中期,菌体产酶水平达6005.66U/L,生产强度为200.19U/L.h,实现了胆固醇氧化酶的高效生产。     

产谷胱甘肽毕赤酵母工程菌的构建及能量调控

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是生物体内重要非编码且含有巯基的三肽类物质,具有调节和保护等功能,在医药、食品等领域有着广泛的应用。目前,工业上主要通过高密度发酵生产GSH,ATP的供应往往成为GSH生产的限制因素。该文以毕赤酵母GS115为出发菌株,整合串联表达来源于酿酒酵母的Scgsh1和Scgsh2基因,在添加氨基酸前体的条件下,GSH质量浓度可达(302.27±5.06)mg/L,较改造前提高2.88倍。之后优化了柠檬酸钠的添加条件,摇瓶水平最高可达(371.12±8.47)mg/L。最后对工程菌的上罐发酵,通过控制乙醇质量浓度优化葡萄糖的补料速率,实现两阶段高效合成GSH,菌体生物量OD 600最高可达257,发酵68 h时GSH产量最高可达2000 mg/L。该研究为GSH的工业化生产提供了策略参考。