克氏原螯虾新型过敏原血蓝蛋白的鉴定及性质研究

以克氏原螯虾为研究对象,鉴定血蓝蛋白的理化性质及其过敏原性。酶联免疫吸附试验结果表明:6份甲壳类过敏患者血清与克氏原螯虾血淋巴发生特异性IgE反应,利用离心和柱层析方法从血淋巴中分离纯化到目的蛋白。SDS-PAGE分析显示纯化的目的蛋白由6个亚基(依次为68,72,76,82,84和88 ku)组成,采用兔抗凡纳滨对虾血蓝蛋白多克隆抗体的免疫印迹试验证实目的蛋白为血蓝蛋白。免疫印迹试验结果显示,纯化的血蓝蛋白与甲壳类过敏患者血清出现了特异的杂交显色条带,表明血蓝蛋白具有IgE结合活性。与克氏原螯虾主要过敏原(原肌球蛋白)相比,血蓝蛋白的糖含量为1.99%,热稳定性好,pH稳定性及对胃蛋白酶的耐受性不如原肌球蛋白,但比原肌球蛋白更耐胰液消化。综合血清学及理化性质分析结果,提示血蓝蛋白是克氏原螯虾的1种新型过敏原。     

蟹类主要过敏原的模拟肠胃液消化及其对过敏原活性的影响

目的:通过模拟肠胃液消化试验,分析锯缘青蟹肌肉中过敏原(原肌球蛋白)的消化特性以及消化对过敏蛋白致敏性的影响.方法:采用美国药典提供的模拟胃、肠液配方,测定青蟹原肌球蛋白和肌原纤维蛋白在体外模拟肠胃环境中的消化稳定性.以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行分析.结果:在模拟胃液反应中,非过敏原蛋白尤其是肌球蛋白重链和肌动蛋白等被胃蛋白酶快速降解,而原肌球蛋白在60 min时仍未被完全分解.在模拟肠液反应中,相对于致敏蛋白,肌球蛋白重链、肌动蛋白等非过敏蛋白在较短的时间内被分解,原肌球蛋白尽管120 min后几乎被完全分解,但会产生一些较稳定的蛋白降解片段.以免疫印迹法检测过敏患者血清,结果分子质量为34 kDa的原肌球蛋白降解产物仍具有过敏原性.结论:蟹类过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性,而且其高分子质量降解产物仍可能引起过敏反应.     

市售国产酱油中大豆、小麦过敏原分析

为明确大豆和小麦发酵酱油中的残留过敏原,采用Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳,免疫印迹和间接性酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法对从当地市场购得的14种酱油进行了分析,用来检测的四种血清包括实验室准备的大豆和小麦的兔血清免疫球蛋白G（immunoglobulin,IgG）以及从医院获得的大豆、小麦过敏病人血清免疫球蛋白E（IgE）。Tricine-SDS-PAGE结果表明,所有酱油样品都没有出现大豆和小麦蛋白的条带;免疫印迹结果表明,所有酱油样品中残留的大豆过敏原是β-伴大豆球蛋白的β亚基和大豆球蛋白的碱性亚基中的一种或两种,但小麦过敏原没有条带出现;酶联免疫结果表明,大豆过敏原含量与酱油酿造工艺与酱油等级有关,低盐固态酱油中检测到的大豆过敏原含量高于高盐稀态酱油,酱油的等级越高,所含过敏原含量相对越低。在所有酱油样品中,小麦过敏原含量极低甚至未检出。     

辐照对虾过敏原抗原性的影响

目的探索辐照对海产品脱敏的效果,研究辐照对虾过敏原抗原性的影响。方法利用SDS-PAGE纯化的虾过敏原(原肌球蛋白)制备高效价、高特异性多克隆抗体,通过酶联免疫实验研究以3、5、7、10 kGy的辐照剂量处理对虾过敏原与患者特异性血清抗体IgE及多抗的免疫亲和力的影响。结果原肌球蛋白经辐照处理后,与患者特异性血清抗体IgE及鼠源多抗IgG的免疫亲和力下降。结论辐照可降低原肌球蛋白的致敏性。     

基于虾类原肌球蛋白共同表位肽抗体的过敏原检测方法

目的建立一种能够同时检测多种虾原肌球蛋白的方法。方法通过合成不同虾类的共同表位肽,制备能够识别多种虾类原肌球蛋白的共同表位肽多克隆抗体,建立快速灵敏的虾类原肌球蛋白酶联免疫检测方法。结果该检测方法在4.79～1400 ng/mL的浓度范围内线性关系良好,其线性回归方程为Y=-19.083X+98.303(R~2=0.9813),最低检出限(IC_(10))为1.85 ng/mL;样品加标回收率在94.37%～103.45%之间;该检测方法与软体动物的原肌球蛋白有交叉反应,与鱼肉蛋白、牛奶、花生蛋白等无交叉反应;批内变异系数为3.4%～9.1%,板间变异系数为12.9%～19.6%,贮藏试验显示该酶联免疫试剂盒可以在4℃下保存6个月以上,能够应用于食品中虾类过敏原的检测。结论采用共同表位抗体,成功建立了基于酶联免疫的过敏原检测方法。     

阴离子交换层析法分离纯化花生主要过敏原Ara h1的研究

Ara h1蛋白是花生的主要过敏原蛋白。本研究从天然的花生提取花生蛋白质,通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析法纯化花生主要过敏原Ara h1。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白纯度,结合免疫印迹实验对Ara h1免疫活性进行鉴定。结果表明：采用阴离子交换层析法纯化出的Ara h1纯度达到90%以上。得率为23.1%。免疫印迹实验表明,此方法纯化出来的Ara h1仍具有免疫原性,能跟花生过敏病人血清特异结合。     

虾类主要过敏原及其检测技术的研究进展

虾是一种肉质鲜美,富含蛋白质的食物,但作为主要致敏原之一,可引起不同程度的过敏反应。该文介绍虾类的过敏机制,虾类主要过敏原（原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、肌质钙结合蛋白、丙酮酸激酶、血蓝蛋白）,并综述了近几年虾过敏原检测技术的研究进展,主要包括免疫学方法、色谱与质谱联用技术、分子生物学方法和传感器技术。对虾过敏原检测技术未来的发展进行展望,以期为进一步的研究提供参考。     

文蛤特异性过敏原免疫识别的初步研究

目的：贝类是人类最优质的食用蛋白资源之一,也是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一,贝类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量,为此开展贝类过敏原的识别检测研究很有必要。方法：通过问卷调查初步了解食物过敏现状,获取自诉贝类过敏患者血清和正常人阴性对照血清,采用特异性IgE 检测试剂盒筛选贝类过敏血清,应用组织捣碎提取蛋白、聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹等实验方法研究文蛤特异性过敏原。结果：文蛤肌肉主要蛋白的相对分子量约为200kD 以上、200、90、80、70、46、36 和24kD,其中能被贝类过敏血清特异性识别的90kD 组分约占文蛤肌肉总蛋白的10%～20%,且主要为盐溶性蛋白。结论：文蛤的特异性过敏原为90kD 蛋白组分。     

小麦中的过敏原在酱油酿造过程中的降解分析

目的 探究低盐固态酱油酿造过程不同阶段小麦过敏原的变化。方法 采用实验室模拟方法酿造低盐固态酱油, 采集酿造过程中的原料小麦面粉和制曲阶段14、27、36和44 h时的样品, 发酵阶段5、10、17、24和30 d, 灭菌前和灭菌后12个样品, 用实验室制备的小麦蛋白的多克隆抗体、免疫球蛋白G以及从医院获得的小麦过敏病人血清免疫球蛋白E对样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和酶联免疫测定不同阶段样品的免疫原性。结果 经制曲、发酵处理和加热灭菌处理后, 凝胶电泳图中小麦面粉中的蛋白条带逐渐减少甚至消失, 其中制曲阶段变化程度最大。小麦过敏蛋白中的主要组分麦醇溶蛋白和麦谷蛋白在制曲阶段后期免疫印迹条带逐渐消失, 在进入发酵阶段第5 d时已完全检测不到免疫印迹条带。酶联免疫实验结果表明, 与未处理小麦面粉样品相比, 制曲、发酵和灭菌等处理过程均会不同程度降低小麦过敏原的抗原性和过敏原性, 在进入发酵阶段的第24 d小麦过敏蛋白含量已低于20 mg/kg, 致敏性基本被消除。结论 在实验室模拟低盐固态酱油酿造中, 小麦过敏蛋白的抗原性和过敏原性在制曲、发酵和灭菌等过程均不同程度降低, 其中制曲阶段作用最大, 成品酱油中小麦的致敏性基本被消除。     

鲤鱼小清蛋白的纯化及其过敏原性鉴定

目的：分离纯化鲤鱼小清蛋白(parvalbumin),并对其进行过敏原性鉴定,为建立鱼类过敏原检测技术奠定基础。方法：采用硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化鲤鱼小清蛋白,采用点杂交和特异性IgE 检测试剂盒筛选鱼类过敏者血清,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术分析确定纯化目标蛋白的性质。结果：硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化方法可以得到电泳纯单一目标蛋白;小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体免疫印迹实验表明,所得纯化蛋白是小清蛋白。此外,免疫杂交结果显示,鱼类过敏者血清能与纯化的小清蛋白发生特异性结合,从而证实了鲤鱼小清蛋白的过敏原性。