N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的异源表达及甘油糖苷的酶法合成

从杆菌状链霉菌中克隆了一个N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-glucosaminidase,NAGase）的编码基因sbnag2550,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。利用镍离子亲和层析得到纯酶后对SbNag2550的酶学性质进行了研究。该酶的最适温度为50℃,在45～60℃均表现出90%以上的酶活力。SbNag2550还表现出优良的热稳定性,在55℃孵育60 h仍能保留将近90%的酶活力。利用SbNag2550催化N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-glucosamine,NAG）和甘油发生逆水解反应,合成了甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷（glyceryl N-acetyl-glucosamine,GNAG）。在最适条件下,反应24 h时转化率达到28.20%,反应72 h时转化率为34.82%。本研究中首次通过酶法合成了GNAG,为其功能研究和应用开发奠定了基础。     

解淀粉芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其酶学表征

从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YX-01)中克隆得到一个新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(BaNagase),并成功在大肠杆菌中异源表达。BaNagase编码616个氨基酸,与B. subtilis来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(AIY91451.1)氨基酸序列相似性最高,为76.97%。通过对比分析,BaNagase属于糖苷水解酶3家族。纯化获得的BaNagase比活力为16.42 U/mg,最适温度65℃,最适pH 6.0,且在低于55℃条件下能保持高于70%的酶活力。BaNagase展现出高的热稳定性和严格的底物特异性,为其高效制备N-乙酰氨基葡萄糖提供了理论支持。     

丙酮对黄粉虫N-乙酰- β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

以丙酮为效应物,研究其对黄粉虫（Tenebrio molitor Linnaeus）N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）活力的影响,结果表明该酶的剩余活力随着丙酮浓度增大而呈指数下降。导致酶活力丧失50%（抑制半衰期,IC50）的丙酮浓度为7.2%,说明丙酮对黄粉虫NAGase有明显的失活作用。该酶的失活过程属于混合型,并进一步测定游离酶（E）和酶底物络合物（ES）与丙酮的结合常数（KI和KIS）,分别为5.32%和27.2%,KI〈KIS，说明底物存在对酶被丙酮的失活作用有一定的保护作用。     

米曲霉外切β-D-氨基葡萄糖苷酶的化学修饰

采用化学修饰剂对采源于米曲霉(Aspergillus Oryzae)的外切β-D-氨基葡萄糖苷酶(GlcNase)进行修饰.氯胺-T(Ch-T)和碳二亚胺(EDAC)的修饰结果表明甲硫氨酸残基和羧基是GlcNase的必需基团.用化学修饰剂对GlcNase的羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键进行修饰,结果表明:修饰剂在较高的浓度范围内均没有引起酶活的显著降低,因此羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键都不是维持GlcNase酶活的必需基团.     

低温β-半乳糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

对来自新疆天山冻土的Rahnella sp.R3所产的胞内低温β-半乳糖苷酶进行纯化,并对其酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Q Sepharose High Performance阴离子交换层析、Sephacryl S-200High Resolution凝胶过滤层析,得到电泳纯酶。酶的活性回收率为21.3%,纯化倍数为35.6,比酶活由1.28U/mg提高到45.54U/mg。SDS-PAGE电泳显示其表观分子量为57.3kDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,在15℃时的酶活为最高酶活的40%,4℃时的酶活为最高酶活的23%。该酶对热敏感,45℃保温45min酶活全部丧失。纯酶的最适pH为7.0,在pH 6.5~7.5时保持稳定。5 mmol/L Na+、Ca2+、Cu2+、Al 3+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,其中Al 3+抑制作用最强,Na+、Ca2+抑制作用不明显。5 mmol/L Mg2+、K+对酶活力具有促进作用,其中Mg2+促进作用较强,使酶活提高到1.19倍。25℃以ONPG为底物的Vmax,Km值分别为7.19mol/(min·mL)、4.64mmol/L。     

乙酰氨基葡萄糖合成关键酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶的筛选及酶学性质分析

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)的衍生物,在保健食品和医药领域具有广泛应用。氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase,GNA)是N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的关键酶。本研究在前期构建的产GlcNAc枯草芽孢杆菌(Bacillus. subtilis,B. subtilis)工程菌的基础上,通过过量表达不同来源的GNA,筛选出来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰基转移酶(Cegna1)最适于加强GlcNAc合成途径。在B. subtilis工程菌中表达Cegna1,摇瓶水平发酵GlcNAc产量达到7.31 g/L,与过量表达来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S. cerevisiae)的GNA的对照菌株相比,GlcNAc的产量提高了24.51%。在3 L发酵罐中进行分批发酵,GlcNAc产量达到24.23 g/L,相较于对照菌株GlcNAc的产量提高了24.69%。进一步研究发现重组Cegna1对GlcN-6P和乙酰辅酶A(Ac-CoA)有着较高的亲和力和催化效率,最后对重组Cegna1的基本酶学性质进行了考察,发现底物GlcN-6P对重组Cegna1的抑制作用明显,下一步可采用定向进化策略改造Cegna1,解除底物GlcN-6P对重组Cegna1的抑制作用。本研究结果为应用定向进化策略改造GNA的实现提供了理论依据。     

草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

草菇(Volvariellavolvacea)在20L发酵罐中以稻草粉为基质进行培养,所产生的β 木糖苷酶(β 1,4 xylosidase,EC3.2.1.37)经硫酸铵沉淀、苯基 琼脂糖(Phenyl agarose)疏水性柱层析、DEAE Sephacel阴离子柱层析、TOSOHASS HW 5S分子筛过滤分离等提纯步骤,达到了电泳纯,提纯倍数为241倍,收率为14.5%.该酶反应的最适pH值为6.41～6.76,最适温度为55℃;在pH值5.78～7.68之间酶活力相对稳定,52℃的半衰期(t1/2)为1h.由凝胶过滤和SDS PAGE测得酶由4个亚基组成,酶的相对分子质量为2825000.在所测定的底物中,β 木糖苷酶仅对对硝基苯基 β D 木糖苷有专一性水解作用,其对对硝基苯基 β D 木糖苷水解的动力学参数Km值为2.4mmol/L,vmax为42μmol/(min·mg).该酶催化对硝基苯基 β 木糖苷水解将产物β 木糖反转成α 木糖.     

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。     

海洋低温β-半乳糖苷酶菌株筛选、鉴定及酶的分离纯化

筛选自黄海海泥产β-半乳糖苷酶的菌株CD6,依据形态学特征、生理生化特征及分子生物学特征鉴定为土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena)。通过透析、超滤和柱层析方法分离纯化菌株β-半乳糖苷酶,测定该酶的最适反应温度为20℃,30℃剩余相对酶活85%;超过35℃酶活力即迅速下降,确定其为低温酶。     

β-N-乙酰葡萄糖苷内切酶Endo S异源表达及发酵优化

Endo S(EC 3.2.1.96)是一种来源于化脓链球菌的β-N-乙酰葡萄糖苷内切酶,可以特异性水解免疫球蛋白G(Ig G)可结晶区(Fc片段)N糖链。为实现其高效表达,本研究构建endo S重组表达大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-endo S,并验证表达蛋白糖苷水解活性,在摇瓶水平单因素优化蛋白质表达,考察了基础培养基种类、碳源、氮源、无机盐、培养基初始pH、发酵温度和时间等因素对产酶的影响,确定最优发酵培养基组成为(g/L):酵母粉10.0,甘油4.0,牛肉浸膏25.4,NaCl 5.0,pH 8.0,最优培养条件为:20℃诱导表达24 h,蛋白表达量为225 mg/L发酵液,是优化前的4.5倍,同时也是目前报道最高表达量的5.6倍。     

韭菜β-木糖苷酶的分离纯化与部分性质研究

新鲜韭菜经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、羧甲基离子交换层析(carboxymethyl-sephar ose,CMSepharose)再通过Su perdex-200凝胶过滤层析,从而获得电泳纯的β-木糖苷酶。该酶的比活力达到18.25 U/mg,纯化倍数为12.59,回收率为1.83%,分子质量为123.02 k D,亚基分子质量为61.51 k D。通过对β-木糖苷酶的酶学性质研究得到最适温度为65℃,最适p H值为4。该酶在25~55℃及p H 3.0~5.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其米氏常数(K_m)值为0.28 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和Ag+对该酶具有抑制作用,Mn~(2+)和Co~(2+)对该酶具有一定的激活作用。     

磷脂酰-N-乙酰氨基葡萄糖苷的合成及脂质体制备

为了提升磷脂酰-N-乙酰氨基葡萄糖苷(PtdGlcNAc)的合成效率,选取不同的咪唑类离子液体,通过以磷脂酶D(phospholipase D,PLD)催化磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)与N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-beta-D-glucosamine,GlcNAc)的转酯反应,探究离子液体预处理对酶催化性能的影响。结果表明,经过1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF₆])预处理后,PLD的活性明显高于其他离子液体组和空白组。因此,采用[BMIm][PF₆]作为PLD预处理的孵育溶液,通过优化实验,得到最佳反应条件为：1 U的加酶量,底物PC与GlcNAc的物质的量比为1∶60,环戊基甲醚作为有机相,离子液体与水体积比为4∶1,反应时间12 h,产率为79.7%,与未处理组的产率相比提升了56.9%。将合成的PtdGlcNAc制备成纳米脂质体,并对其结构进行了初步表征。该研究丰富了PLD反应体系的相关研究,为其他新型磷脂酰化合物的合成和应用提供了参考。     

K.fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的分离纯化

分别采用柱色谱技术对K.fragilisLFS-8611 β-D-半乳糖苷酶进行了纯化，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定了该酶的纯度。粗酶先后经过(NH4)2SO4分级沉淀、CM-Sepharose CL-6B、DEAE-Sepharose CL-6B、Sephacryl S-200柱色谱四步分离纯化，酶的最终回收率为16％，纯化倍数为45．8。纯化的酶在SDS-PAGE上为一条染色谱带，相对分子质量约为60000。     

黑曲霉内切β-葡聚糖酶的纯化和性质

黑曲霉(Aspergillus niger)的粗酶滤液经过硫酸铵沉淀和四种色谱CM-Sephadex C-50离子交换色谱、DEAE-Sephadex A-50离子交换色谱、POROS 20 HQ离子交换色谱和TSK-G3000SW凝胶色谱,从中提纯了一个新的内切β-葡聚糖苷酶该酶经SDS-PAGE电泳检测分子量为36.0KD,该酶活力的最适温度为70℃,最适pH值为3.6 纯化后的该酶只能降解羧甲基纤维素,不能降解微晶纤维素,对蔗糖、麦芽糖和纤维素也不起作用。其N-末端部分氨基酸序列为V F E W F G C N E C G A E F Tx N I P G。     

绿豆β-葡萄糖苷酶的分离纯化与性质研究

本文采用硫酸铵分级沉淀、超滤、DEAE-52离子交换、Sephadex G-100凝胶层析纯化的方法,对绿豆β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化,并对纯化酶的部分特性进行了研究。研究结果表明,绿豆中含有两种β-葡萄糖苷酶同功酶,两种同功酶分别被纯化了3.02倍和7．24倍,收率分别为46．75％和91.14％：同功酶的分子量分别为92．4kDa和140．0kDa,其中一种为双亚基蛋白酶：该同功酶的最适反应温度分别为50℃和20℃;最适反应pH值分别为6．0和5．0;两同功酶对对硝基苯-β-D-葡萄糖苷有相似的亲和力。     

鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶的分离纯化和性质研究

目的从鲜地黄分离纯化β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶,并研究其性质。方法通过磷酸盐缓冲液提取、两步硫酸铵盐析和两步凝胶柱层析,分离纯化鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶。以pNPG为底物,研究两种酶的最适反应温度及温度稳定性。结果与结论从鲜地黄中分离得到1种β-葡糖苷酶和3种α-半乳糖苷酶同工酶。研究发现β-葡糖苷酶热稳定性较差,在50℃即迅速失活;而α-半乳糖苷酶在50℃总酶活性最高,热稳定性较好,70℃以上时活性迅速下降。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

将来自嗜热脂肪芽孢杆菌IAM 110 0 1的高温乳糖酶基因bgaB亚克隆到具强启动子的大肠杆菌载体 pKK 2 2 3 3中 ,经IPTG诱导后 ,表达出的重组蛋白质仍具有耐高温活性 ,其相对分子质量与天然蛋白质相似 ,表达量为 1.5U/mg ,比出发菌株高 10倍     

产β-葡萄糖苷酶真菌的筛选鉴定、纯化及酶学性质分析

经刚果红平板染色法从土样中筛选到3株产纤维素酶的真菌,通过对其β-葡萄糖苷酶活力的测定,选择一株相对活力较高的菌株进行菌种鉴定。在形态鉴定的基础上,通过内转录间隔区(ITS)序列构建系统发育树初步鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae),命名为giF-10。对米曲霉giF-10进行摇瓶发酵,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE Cellulose 52离子交换层析进行纯化。得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,比活力为40.84U/mg,分子质量约90kD;该β-葡萄糖苷酶最适温度为55℃;在30～50℃之间热稳定性好;最适pH值为4.5;pH4.0～6.0稳定性好;金属离子对酶活力具有一定的影响,Mn2+对酶具有较强的激活作用;Fe3+和Cu2+对β-葡萄糖苷酶活力有较强的抑制作用;该酶对水杨素和纤维二糖具有较强的底物特异性;β-葡萄糖苷酶对水杨素的动力学参数：Km为0.676mmol/L;对纤维二糖的动力学参数为：Km为2.906mmol/L。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF（Q-Sepharose FF）离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水层析和丁基-琼脂糖凝胶HP（Butyl-Sepharose HP）疏水层析对黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子质量,并对其酶学性质进行研究。结果表明,经分离纯化后得到分子质量约为116 kDa的β-葡萄糖苷酶,纯化倍数达到50.39倍,回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg,该β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH值为5.0,在温度30～50 ℃,pH 2.0～8.0之间具有较好的稳定性。     

黑曲霉DB056分泌的柚苷酶分离纯化及酶学性质研究

对黑曲霉DB056发酵产生的柚苷酶进行分离纯化并研究其基本特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析分离,所得柚苷酶的比活力为1716.41U/mg蛋白,纯化倍数为17.52倍。柚苷酶具有4个相对分子质量的组分,较适pH值范围4.0～5.0,最稳定的pH4.5;该酶适宜的作用温度范围45～55℃,温度50℃时酶活力最大,45℃和50℃条件下可以分别稳定4h和2h,55℃时柚苷酶1h失活50%;Ag+、Hg2+对柚苷酶具有强烈的抑制作用,其它金属离子对柚苷酶的影响随离子浓度的不同而不同,如0.1mmol/LCa2+、K+、Al3+、Mn2+、Cu2+可提高柚苷酶的活力,而5.0mmol/LFe2+、Al3+对柚苷酶显示抑制作用。