谷氨酰胺产生菌NS611的代谢流分析

建立并完善了谷氨酸棒杆菌NS611生产谷氨酰胺的中心碳代谢网络.研究了菌体生长和生产阶段的代谢流分布,结果说明该菌葡萄糖的代谢以糖酵解途径为主,在产酸阶段丙酮酸羧化反应的代谢流量较大。NADPH不是谷氨酸棒杆菌NS611代谢的限制性因素.研究了氮饥饿处理对代谢流分布的影响,提出要提高谷氨酰胺的产量必须适当保留α-酮戊二酸的向下氧化的功能,以保证能量供给.     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酰胺

L-谷氨酰胺（L-glutamine,L-Gln）是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产L-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性能欠缺等问题严重限制了其工业化应用。为解决这一问题,作者以实验室前期构建的L-Gln生产菌株CGQ03为出发菌株,通过强化谷氨酸脱氢酶表达及辅因子NADPH供应促进前体L-谷氨酸合成、增强辅因子ATP胞内含量、过表达溶氧相关蛋白VHb提高细胞携氧能力、增强关键酶谷氨酰胺合成酶催化活性及发酵工艺优化等策略提高了L-Gln产量。最终的基因工程菌CGQ08/pDXW10-glnASc-gdhCg在5 L发酵罐上补料分批发酵66 h,L-Gln的产量最高达（94.5±1.8） g/L,糖酸转化率为34.8%,生产强度为1.43 g/（L·h）。本研究为L-Gln及其相关化合物的工业化生产提供了借鉴。     

琥珀酸对谷氨酸棒杆菌谷氨酸合成的影响

研究了在发酵培养基中添加琥珀酸对谷氨酸棒杆菌谷氨酸合成的影响。琥珀酸的添加使菌体生长受到一定程度的抑制，残糖有所升高，但是增加了谷氨酸的合成量。当琥珀酸添加量分别为3g／L、5g／L、7g／L、lOg／L、和20g／L时，谷氨酸合成量分别增加了3．57％，20．53％，46．43％，64．29％和81．25％。未见有类似的研究报道。     

谷氨酰胺合成酶抑制剂对衰老期烟叶氮代谢的影响

通过质外体提取和测定氮素代谢相关酶等方法,调查了不同浓度谷氨酰胺合成酶（GS）抑制剂（Glufosinate）对2个氮效率烤烟品种氮代谢相关生理指标的影响。结果表明,GS抑制剂可以有效抑制衰老期间烟叶GS活性,使氮素再同化能力下降,促进氮素营养物质的降解,并诱导谷氨酸脱氢酶（GDH）活性升高和硝酸还原酶（NR）活性下降,使叶片NH₄⁺积累,增大了氨气挥发潜力,且随着GS抑制剂浓度的升高,抑制效果更加明显。氮低效品种与氮高效品种相比,衰老速度快,叶片NH₄⁺的积累量小,氨气挥发潜力大,品种间差异显著。GS抑制剂可以加速叶片衰老,促进氮素降解和再转移。     

谷氨酸棒杆菌脂肪酸合成酶fasA基因的异源表达对脂肪酸合成的影响

旨在为脂肪酸高产菌株的筛选和构建奠定理论基础,研究谷氨酸棒杆菌脂肪酸合成酶A(FasA)对大肠杆菌脂肪酸合成的影响,利用生物信息学软件预测分析了FasA的性质并构建过表达载体pXMJ19-fasA,转化至大肠杆菌进行表达,对表达诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度进行考察,并测定了异源表达后的脂肪酸组成。结果表明,重组菌株在IPTG浓度为1 mmol/L下诱导20 h,棕榈油酸和油酸产量分别达到1.735、2.325 mg/g,与对照菌株相比分别提高了53.95%和59.68%。研究结果说明FasA对大肠杆菌合成棕榈油酸和油酸有促进作用。     

营养因素及环境因子对合成L-组氨酸的影响

本文以谷氨酸棒杆菌TLU05（5-MT^r＋SC^r＋5-FT^r＋8-AC^r＋6-MP^t＋2-TA^r）为出发菌株，在摇瓶水平上考察了碳源、氮源和无机盐等营养因素及环境因子对合成L-组氨酸的影响。在上述条件下，72h摇瓶可积累L-组氨酸达23-24g／L。     

氮饥饿/过氧化氢协同胁迫促进法夫酵母合成虾青素

虾青素是一种强抗氧化剂,在细胞抵御外界环境胁迫方面起到重要作用。研究了氮饥饿/过氧化氢协同胁迫对法夫酵母合成虾青素的影响,结果表明:低含氮量有利于虾青素的合成,随着碳氮比的降低,虾青素的合成受到抑制,最佳的碳氮比为3∶0.6,每克干细胞虾青素的含量最高达0.32mg/g;在此基础上添加5mmol/L过氧化氢协同胁迫法夫酵母可进一步提高虾青素的产量,在发酵24h(对数生长期)加入3mmol/L的H2O2,36h补加2mmol/L,虾青素产量达到0.59mg/g,比空白对照提高63.9%。      

谷氨酸棒杆菌合成脂肪酸的研究进展

脂肪酸对于工业以及生物体都具有极其重要的作用。谷氨酸棒杆菌被广泛用于氨基酸、核苷酸以及脂肪酸等高附加值化学品的工业生产。文章结合近年来谷氨酸棒杆菌生产脂肪酸取得的最新成果,综述了脂肪酸微生物合成的代谢途径以及代谢工程进展,并展望了将来的研究方向。     

谷氨酰胺合成酶(GS)的制造法

综述了谷氨酰胺合成酶(GS)的制造方法。     

L-色氨酸产生菌TQ2223的途径分析

应用途径分析方法分析了在稳态时谷氨酸棒杆菌TQ2223菌株由葡萄糖发酵生产L 色氨酸的途径,确定了L 色氨酸合成的最佳途径及其代谢流分布和最大理论产率.通过刺激所选途径的酶活来提高L 色氨酸产率,结果表明,经NH4+调节后,代谢途径流量发生显著变化,可以使色氨酸的代谢流从6提高到8.8.     

谷氨酸棒杆菌生产L赖氨酸的培养优化和产酸特性研究

在5L发酵罐中利用优化培养基进行了谷氨酸棒杆菌连续培养生产L-赖氨酸的研究。相同发酵条件下,优化培养基和原始培养基中的菌种生物量分别达到8.0g/L和9.3g/L,最快生长速率分别为0.53g/L/h和0.72g/L/h。发酵48h后,优化培养基中的L-赖氨酸浓度、产酸总量和糖酸转化率分别为20.8g/100mL、588.2g和0.713g酸/g糖,和原始培养基相比分别提高了6.1%、2.3%和12.2%。优化培养基显著降低了L-赖氨酸生产的原料消耗,提高了生产效率。      

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

基因组改组快速提高谷氨酸棒杆菌L-鸟氨酸产量

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌,应用基因组改组技术快速提高L-鸟氨酸产量。经过紫外线、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得6株产量有所提高的突变株,以此构建用于基因组改组的候选菌库。考察培养基成分对原生质体再生率的影响。经过两轮的灭活原生质体递推式融合,以磺胺胍和氟化钠为双抗性筛选标记,共筛选出2株遗传性能稳定的改组菌株。其中改组菌株F2-6摇瓶发酵72h,积累L-鸟氨酸产量为2.99g/L,是出发菌株的13.6倍。结果表明基因组改组技术能够在短期内使谷氨酸棒杆菌的L-鸟氨酸产量得以提高。     

谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建

在芳香族氨基酸合成途径中,由分支酸产生两个分支:一方面,在邻氨基苯甲酸异构酶(ANS)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(PRT)和色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸;另一方面,分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下生成预苯酸(PPA),由预苯酸又产生两个分支,最后生成酪氨酸或苯丙氨酸。在该途径中,3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶(DS)是关键酶。以谷氨酸棒杆菌SPT9(Phe-、Tyr-、4-FPr、6-FTr)为出发菌株,通过同源重组敲除分支酸变位酶基因csm获得菌株SPT9?csm。将编码DS、ANS和PRT、TS的基因aroⅡ、trpEGD及ts在SPT9?csm中分别过量表达和串联过量表达,获得一系列重组菌:SPT9?csm-XK99E-aroⅡ-trpEGD、SPT9?csm-XK99E-ts、SPT9?csm-XK99E-cspB-ts、SPT9?csm-mob2-ts和SPT9?csm-mob2-ts-aroⅡ-trpEGD。这五株菌摇瓶发酵72 h后,色氨酸产量相对于出发菌株SPT9分别提高了21.4%、57.1%、100%、121.4%和178.6%。通过实时荧光定量PCR检测表明,ts、aroⅡ和trpEGD基因在重组菌SPT9?csm-mob2-ts-aroⅡ-trpEGD中的表达量是它们在菌株SPT9中的9.2倍、13.0倍以及10.6倍。     

葡萄糖亚适量流加对谷氨酸棒杆菌产L-异亮氨酸的影响

通过动态调节葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的供应速率,解决菌种在发酵产L-异亮氨酸不同时期对葡萄糖消耗能力差异的问题。实验结果表明,以谷氨酸棒杆菌YILM1504为供试菌株,在发酵初始葡萄糖添加量80 g/L、90%最大补糖速率的亚适量补糖工艺下,得到动态补糖速率为0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h）,L-异亮氨酸达到44.32 g/L,糖酸转化率为19.63%。经代谢流对比分析发现,葡萄糖经戊糖磷酸途径和糖酵解途径代谢流之比为0.56,进入Ile的代谢流增强了18.92%,进入缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸的代谢流减弱了67.12%、72.21%、30.23%,该方法针对谷氨酸棒杆菌在细胞生长阶段与产酸阶段不同的耗糖能力,提供了精细的补糖速率策略,产酸高峰期明显延长,副产物积累比例得到降低,原料利用率大幅提升。     

搅拌对谷氨酸棒杆菌絮凝的影响

谷氨酸棒杆菌等电点为4.2,当等电母液pH在3.2左右时,菌体zeta电势为正值,添加絮凝剂聚丙烯酸钠能有效使分散的细胞聚集成絮凝体。以菌体、COD及蛋白质去除率为指标,借助Mastersize 2000测定絮凝体粒度分布,考察了搅拌速率和搅拌时间对絮凝的影响。结果表明,在搅拌转速为400 r/min,搅拌时间为50 s时,絮凝效果最好,菌体、蛋白质、COD去除率分别达到99%、75%、55%以上,絮凝体粒径达到491μm,C.V.值为53.52%。搅拌速率和搅拌时间在很大程度上影响絮凝效果和絮凝体大小,控制搅拌速率和搅拌时间可以优化絮凝效果和优选絮凝体大小,增强絮凝后的沉降过滤。     

利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究

丙酮酸是一种重要的有机酸,可以作为前体物质,参与合成多种有机化合物,在生物体的能量代谢中发挥着重要作用。为提高丙酮酸产量,选择利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产丙酮酸。利用同源重组的方法,依次敲除谷氨酸棒杆菌中与丙酮酸代谢支流相关的5个关键基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE),摇瓶发酵72h后丙酮酸的产量达到14.64g/L。通过过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,增加合成丙酮酸前体物质的供应。最终,复合培养基摇瓶发酵72h后,发酵液中丙酮酸的产量达到15.39g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。研究旨在为利用微生物发酵生产丙酮酸提供一定的理论参考。     

谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢阻断工程菌的构建

采用反向代谢工程的策略,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032野生型为出发菌株,利用无抗性标记的同源重组方法,敲除了编码葡萄糖pts系统关键转运蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖转运系统关键转运蛋白基因abc、abc2和iolt1,得到了5株逐次敲除了相应基因的突变株。结果表明:当以葡萄糖为唯一碳源培养时,CGΔptsG菌株的葡萄糖的消耗是野生型的50%,菌体OD值为1.473;CGΔptsH-ptsI菌株的葡萄糖的消耗是野生型的39.5%,菌体OD值为1.226;CGΔabc菌株的葡萄糖的消耗是野生型的36%,菌体OD值为1.092;CGΔabc2菌株的葡萄糖的消耗是野生型的26.2%,菌体OD值为0.486;CGΔiolt1葡萄糖的消耗和菌体生长OD值为0,实现了谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢的阻断,说明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所编码的转运蛋白具有葡萄糖转运功能。     

增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响（英文）

该实验考察和比较增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成Lacterium glutamicum-异亮氨酸的影响。通过以L-异亮氨酸生产菌Corynebppc YI为出发菌株,分别采用基因组整合和质粒的方式过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因及丙酮酸羧化酶编码基因pyc。结果表明,获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01和ILE02,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高17. 3%(6. 1 g/L)和9. 6%(5. 7 g/L)、发酵罐条件下分别提高11. L7%(24. 8 g/L)和8. 1%(24. 0 g/L)。获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03和ILE04,摇瓶条件下菌株-异亮氨酸产量分别提高(30. 8%(6. 8 g/L)和13. 5%(5. 9 g/L)、发酵罐条件下分别提高15. 8%(25. 7 g/L)和9. 5%24. 3 g/L)。此外,过表达pyc和ppc还可不同程度地提高L-异亮氨酸转化率。然而采用质粒过表达pyc和ppc均使得菌株生物量下降。因此,过表达pyc和ppc均能显著提高L-异亮氨酸产量和转化率,基因组整合的过表达方式效果优于质粒...