真菌α-淀粉酶酶学性质研究

真菌α-淀粉酶是淀粉生产麦芽了对比研究.结果表明:两种酶最佳试验稀释倍数为1000;最适pH值均为5.5;在50℃以下时热稳定性较好,高于60℃时酶活损失较多;Ca2 浓度在7mmol/L时对两种酶都有激活作用.     

N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA酶学性质的影响

为探索N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶Apk A酶学性质的影响,同时为构建酵母工程菌奠定基础,将Apk A缺失信号肽突变体Apk Ads及含有2个潜在N-糖基化修饰位点的突变体Apk Ads D182N/G373S在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。Apk Ads和Apk Ads D182N/G373S在Pichia pastoris GS115中大量表达并分泌到胞外,Apk Ads的表观分子质量约为45 k D,Apk Ads D182N/G373S的表观分子质量约为55 k D。酶学性质分析表明,与Apk Ads相比,Apk Ads D182N/G373S的酶学性质发生了一定的变化。其最适反应p H值由6.5降低至5.5~6.0,酸性条件下稳定性增强;最适反应温度由90℃提高至100℃;于90℃的半衰期由5 h增加至5.5 h,于100℃保温10 min后的相对酶活力由32.03%增加至49.04%。结果表明N-糖基化修饰可适当提高Apk A的酸性条件下酶活力和稳定性、最适反应温度、热稳定性。突变体Apk Ads D182N/G373S的酶学性质使其适于淀粉液化工艺的应用。     

酸性α-淀粉酶菌株的诱变及酶的性质研究

以醋醅中筛选出产α-淀粉酶的酵母菌为出发菌进行N 离子注入诱变,使产物酶活提高了219%,达到497U/g。对其所产-α淀粉酶进行分离纯化,实验表明,该酶的最适温度为60℃,最适pH值为4.0,分子量约为81kDa,Ca2 对该酶的激活作用不明显。薄层层析结果表明,该酶水解淀粉产物为糊精和多种低聚糖。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

酸性α-淀粉酶生产菌株的筛选和酶的纯化及酶的性质研究

从土壤中筛选得到一产酸性α-淀粉酶的野生青霉菌株，对其所产酸性α-淀粉酶进行分离纯化，该酶反应的最适pH值为4.4，最适温度为60℃，分子量约为85kD。薄层层析结果表明该酶水解淀粉生成糊精和多种低聚糖。     

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。     

一株高产淀粉酶扣囊复膜孢酵母的产酶条件优化及酶学性质研究

对筛选自芝麻香型白酒高温大曲中的1株高产淀粉酶扣囊复膜孢酵母的产酶条件和酶学性质进行研究。在单因素实验的基础上,运用响应面分析,优化得到菌株最佳产酶条件:原料添加量20 g,含水量51%,接种量18%,发酵温度24℃,在此条件下,经72 h固态发酵,淀粉酶活力达到12 297 U/g,比优化前提高了约63. 96%;进一步对菌株所产淀粉酶性质进行初步研究,该淀粉酶最适作用温度为50℃,最适作用p H值为4. 0。实验结果表明,所筛选菌株产淀粉酶能力较强,性能优良,且所产淀粉酶能够适应大曲发酵的酸性高温环境,具有应用于高温大曲生产的潜力。     

一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选及酶学性质研究

从酿造大曲中筛选到高产α-淀粉酶菌株A-5-3,对其进行生物学鉴定,鉴定结果为黑曲霉;对其发酵液进行酶学性质初步研究,结果表明:该酶的最适pH值为3.6,最适温度为70℃,热稳定性良好。在pH3.0~5.0之间,具有很好的酸稳定性且为非Ca2+依赖型水解酶,在工业生产上有良好的应用前景。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

Sulfolobus tokodaii strain 7高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质

以超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7基因组DNA为模板,通过PCR扩增高温酸性α-淀粉酶基因ST0817,将此基因克隆至表达载体pET15b,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,获得重组大肠杆菌工程菌。通过热处理、镍柱亲和层析和分子筛层析,得到纯化重组酶,SDS-PAGE分析表明,该酶分子量为53.0 kDa。酶学性质研究表明,该酶最适温度和pH分别为75℃和5.5;具有较强的热稳定性和pH稳定性,在85℃处理8 h保持50%左右活力,在pH 5.2处理120 min仍保持50%活力。此酶对不同底物水解活性不同,直连淀粉>可溶性淀粉>支链淀粉>β-极限糊精>糖原>环糊精>普鲁兰糖;该酶对有机溶剂、变性剂和金属离子具有一定抗性。     

酸性生淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究

酸性生淀粉酶在淀粉制糖中具有重要的开发价值。本实验从醋厂醋渣、淀粉厂排污口泥土分离到酸性条件下α-淀粉酶活力较高的三株菌,其中B-5所产α-淀粉酶最适pH为5.0,为酸性α-淀粉酶。对三株菌粗酶液降解生淀粉的能力进行比较,可知B-5、B-1降解生淀粉能力较强,而B-6虽然有较高的α-淀粉酶活力,但其生淀粉降解能力却较低,粗酶液降解后的生淀粉电镜图片也说明了此结果。      

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

真菌α-淀粉酶和麦芽糖α-淀粉酶对馒头粉品质改良的比较研究

从提高小麦粉质量、延长馒头货架期的角度出发,以国产小麦粉作为试验用粉,通过粉质试验、降落数值测试、蒸馒头试验及质构测试等分析方法,研究了真菌α-淀粉酶和麦芽糖α-淀粉酶在国产小麦粉中发挥改良作用的应用效果。结果表明:真菌α-淀粉酶对馒头粉综合品质的提高优于麦芽糖α-淀粉酶,而麦芽糖α-淀粉酶在馒头贮存过程中的抗老化效果优于真菌α-淀粉酶。     

重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为：诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。     

大麦β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达

大麦来源的β-淀粉酶具有稳定性高和工业应用效果好的优点,被广泛应用于食品、酿造以及粮食加工,但是其制备成本高,价格较昂贵。该研究使用大肠杆菌异源表达大麦来源的β-淀粉酶。首先通过基因合成技术获得密码子优化的大麦来源的β-淀粉酶基因,将该基因通过质粒p ET28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达获得重组β-淀粉酶。其次,对重组表达的β-淀粉酶和大麦中直接提取的β-淀粉酶进行酶学性质比较分析。结果表明,重组表达的β-淀粉酶其分子质量大小与大麦中β-淀粉酶一致,即59 k Da,重组的β-淀粉酶比酶活由大麦来源的588 U/mg降为285.5 U/mg,最适作用温度降低了10℃,最适p H保持一致。所以,大麦β-淀粉酶能够在细菌中高效表达,但是其酶学性质发生较大改变。     

酸性α-淀粉酶生产菌株的筛选及酶学性质研究

从土壤中筛选到一株产酸性α-淀粉酶的野生菌株N7,此菌株具有较高的产酶活性。通过菌落形态、菌体特征观察和16SrDNA序列比对,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。其酶学性质研究表明,菌株代谢产酶的反应最适温度为53℃,最适作用pH值为4．6,在pH3．0～10．0之间,具有较好的酸稳定性。     

合成嗜热酸性淀粉酶的毕赤酵母表达

把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶的基因BD5088,引入载体pPIC9K中,将正确构建的重组质粒pPIC9K-BD5088转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,重组超耐热酸性α-淀粉酶PrBD5088在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外。该酶受甲醇的严格调控和诱导,在诱导培养5 d后酶活力达到最大值,表达量可达到约200 mg/L。与原核表达产物ErBD5088相比,PrBD5088的酶学性质发生了一定的改变。其最适反应温度由80℃增加到90℃。最适反应pH值仍为pH5.6,但范围更宽,在pH值5.0～6.5之间,其相对酶活在90%以上,在pH4.0～8.0范围内酶活性保留50%以上。而ErBD5088则只在pH5.0～7.0范围内能维持活性的50%以上。且PrBD5088的温度稳定性远高于ErBD5088。PrBD5088在100℃条件下热处理1 h仍具有80%以上的酶活力,而ErBD5088相同条件下的半衰期只有20 min。此外,Ca2+和Zn2+对维持rBD5088活性和稳定性会产生轻微促进作用,该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。SDS-PAGE测得该酶的分子量为56 ku,高于原核表达的酶蛋白。重组α-淀粉酶PrBD5088不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象。本实验结果表明O-连接糖基化可适当提高PrBD5088的热稳定性、最适温度和酸性pH条件下酶活性。     

大豆β-淀粉酶基因在毕赤酵母中的高密度发酵表达

大豆β-淀粉酶在麦芽糖浆生产上具有应用优势。该研究应用毕赤酵母表达系统异源表达大豆β-淀粉酶,并对重组酶的酶学性质进行了分析,结果显示,其酶学性质没有改变。为了增强重组β-淀粉酶的表达,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导的毕赤酵母表达策略,10 L发酵罐发酵表达的重组β-淀粉酶酶活力为310 U/mL,比单一甲醇诱导提高了36%。研究结果表明,发酵条件优化对提高异源β-淀粉酶在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

真菌α-淀粉酶制剂的提纯及保存方法

以米曲霉ZLF13菌株经固态发酵生产的真菌α-淀粉酶粗制品(发酵曲)为原料,对其提纯、精制的工艺条件和保存方法进行了研究。其最佳提纯工艺条件为:培养好的发酵曲采用40℃温水,pH值7.5左右,加水比为1∶4,浸泡3 h。压滤滤液经超滤浓缩后,在10~15℃,pH 6.0~6.5,与食用酒精混合为酒精体积分数为70%的溶液中静置沉析,过滤后于40℃低温干燥。采用该工艺条件进行粗酶提纯,产品综合回收率稳定在70%以上,最高达到74%,产品酶活力最高达25 416 u/g,平均达16 608 u/g,卫生标准达到食品级标准。通过精制酶的保存试验研究,确定了一种真菌α-淀粉酶稳定剂配方,其添加至精制酶后,常温下半年的酶活力保存率达到95%以上,1年的保存率可达到90%以上。     

耐高温α-淀粉酶的酶学性质研究

耐高温α-淀粉酶是淀粉生产麦芽糖的关键酶。本文对两种耐高温α-淀粉酶的酶学性质进行了对比研究。结果表明：两种酶的耐高温能力差别较大，酶活差别明显；最适pH值均为7．0，耐酸性较差：当Ca^2＋浓度在7～9mmol／L时，酶活提高明显。