反转录PCR技术检测贝类中诺瓦克样病毒的研究

目的:从病毒富集和核酸提取两方面进行探索,旨在建立一个反转录(RT)PCR技术检测贝类中诺瓦克样病毒(NLVs)的方法.方法:利用脊髓灰质炎病毒作为参照毒株,优化甘氨酸缓冲液一聚乙二醇(PEG)病毒浓缩方法;同时比较异硫氰酸胍法、SDS一蛋白酶K法、Trizol-异丙醇法、试剂盒法4种RNA提取方法:对市售贝类样品进行了检测,并利用基因测序对阳性样品进行验证.结果:采用pH 9.5甘氨酸缓冲液-16%聚乙二醇病毒浓缩法,病毒的回收率为16.8%;利用Trizol-异丙醇法提取RNA,检出限为8.1×102 RT-PCR50/5gg贝肉;实际检测贝类样品25件,其中3件样品为阳性,基因测序结果亦证实为阳性.结论:建立了一个灵敏度较高的RT-PCR检测贝类中诺瓦克样病毒的方法.     

RT-PCR法检测贝类中的甲肝病毒的研究

在世界范围内,甲肝病毒是与食用贝类有关的主要传染性疾病之一。由于贝类中含有PCR抑制剂以及病毒富集过程中病毒的回收率低,阻碍了天然污染的贝类中HAV的PCR检测。研究中建立了一种经苷氨酸缓冲液洗涤,2次PEG沉降富集病毒,然后进行RNA提取和RT-PCR对贝类中的甲肝病毒进行检测的方法。经比较,采用小体系肠道样品检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了PEG8000和PEG6000对病毒富集的效果,回收率分别为13.5%和7.6%,此方法可有效地降低PCR抑制剂的影响,最低检测限可达10个TCID50/1.5 g。     

贝类中诺如病毒的研究进展

从贝类中诺如病毒的污染现状、检测组织靶点、病毒浓缩方法及效率、检测方法有效性等多个方面评述贝类中诺如病毒的研究现状、进展、急需解决的问题和未来的发展方向,以期为制定诺如病毒检测技术标准及我国贝类进出口贸易提供参考。     

肉品中致病菌的多重PCR检测及固相化试剂盒的研究

沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌0157:H7是肉品中的重要食源性致病菌,建立其快速检测方法对肉品的质量控制具有重要作用.本研究根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因以及人肠杆菌0157:H7的咖E基因,分别设计出三对特异性引物,通过对多重PCR反应体系和条件的优化,建立多重PCR检测体系,并集成快速检测试剂盒.结果表明,该方法简单快速且灵敏度高,在肉品中的检测灵敏度可达1CFU/g,整个检测时间在24h以内.集成的试剂盒检测性能良好,具有较强应用价值,可推广应用于食品卫生检测以及临床检验等领域.     

诺瓦克样病毒及其检测方法

诺瓦克样病毒是一种分布广泛,可导致成人和儿童急性胃肠炎的病毒,是除轮状病毒外最主要的致腹泻病毒病原,与食物、水源等污染造成的急性胃肠炎暴发密切相关。现对诺瓦克样病毒的病原学、流行病学、临床表现和诊断检测等方面的研究进展作一介绍。     

实时荧光RT-PCR检测贝类中的札幌病毒

建立检测贝类中GⅠ、GⅡ、GⅣ和GⅤ型札幌病毒的实时荧光RT-PCR新方法。首先使用PEG 8000对贝类中的札幌病毒进行富集,然后采用Tri-reagent提取材料中的总RNA,针对札幌病毒RNA 3'端含Poly A尾的特点,使用带有Poly(dT)25的磁珠对病毒RNA进行纯化,用所获的高纯度RNA进行四种型别札幌病毒的实时荧光RT-PCR检测。该方法高效、灵敏,检测下限为101数量级拷贝,能够用于日常检验。     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

生物传感器在贝毒快速检测中的应用

贝类毒素是继病原菌、弧菌和病毒之后,又一威胁海洋水产品质量的重要问题。随着水产品的安全性越来越受到关注,生物传感器作为一种新的分析工具,在水产品贝类毒素检测中具有广泛应用价值。文中简单介绍了贝类毒素和生物传感器及它们的特点,重点回顾了近年来生物传感器在贝毒快速检测中的应用。     

实时逆转录聚合酶链式反应检测活的金黄色葡萄球菌

针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。     

磷酸酶抑制比色法快速测定贝类中腹泻性贝毒素

基于腹泻性贝毒素(Diarrhetic shellfish poisoning,DSP)的致腹泻性组分大田软海绵酸(okadaic acid,OA)及其衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxins,DTXs)能抑制蛋白磷酸酶活性的特点,建立了快速测定贝类中DSP的磷酸酶抑制比色分析方法。采用对硝基苯磷酸二钠(p-nitrophenyl phosphate disodium,p-NPP)为底物,其与蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)反应生成的黄色水解产物在碱性条件下于405 nm波长处有强烈的吸收峰,根据吸光度值计算抑制剂的浓度。酶抑制法继承了小鼠生物法能建立剂量-效应关系的优势,直接反映毒素的相对毒性大小,测定的是DSP毒素致腹泻性成分的总量,以OA浓度计。本研究优化了样品前处理方法并考察了基质浓度的影响。方法的筛选检出限为80μg/kg。采用该方法进行加标回收实验,回收率在90.43%~118.52%范围内,相对标准偏差(RSD)为6.85%~13.93%。该方法操作简便、快捷,回收率高,重现性好,可作为快速筛查工具用于贝毒的日常监控。