耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。      

马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶合成条件的优化及其酶学性质表征

β-半乳糖苷酶是广泛使用的食品添加剂,主要用于降解乳制品中的乳糖,缓解乳糖不耐受症状。该研究对实验室保藏菌株马克斯克鲁维酵母的发酵条件进行了优化。在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米浆干粉、40℃、初始pH 6.5、150 r/min的条件下,粗酶液的酶活力为26.3 U/mL,表明该菌株具有利用廉价碳氮源高效生产β-半乳糖苷酶的潜力。通过DEAE阴离子交换层析进一步纯化得到比活力为124.09 U/mg的纯化酶。纯化后酶的最适温度40℃,最适pH 6,K_m为5.28 mmol/L,k_cat为4.74 s^-1。此外,发现该酶受Mg²⁺的促进,在20～40℃表现出优异的热稳定性,40℃下30 min仍能保持95.6%的活力。因此,马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶比乳酸克鲁维酵母的热稳定性更好,具有潜在的工业应用潜力。     

马克斯克鲁维酵母菊粉酶的分离纯化和酶学性质研究

马克斯克鲁维酵母产生的孢外菊粉酶经超滤浓缩、DEAE-Cellulose阴离子交换色谱、SephadexG-100凝胶色谱分离纯化,得到两个菊粉酶组分ExoⅠ和ExoⅡ,I/S值分别为0.0249和0.0253,均属外切菊粉酶。ExoⅠ经聚丙烯酰胺凝胶鉴定为均一组分,分子量为85kD。ExoⅠ最适pH值为4.0,最适温度为60℃,Mn2+和Mg2+对酶活力有促进作用,而Cu2+、Fe2+对酶活力有抑制作用,ExoⅠ水解菊粉溶液的产物为果糖和少量葡萄糖。     

克鲁维酵母SK16.001 β-半乳糖苷酶的纯化工艺研究

采用不同分离手段纯化获得克鲁维酵母SK16.001中β-D-半乳糖苷酶。结果显示,通过硫酸铵分级盐析、透析脱盐、DEAE-fastflow离子强度梯度层析、Superdex G-75凝胶过滤后,酶的最终回收率为30.5%,纯化倍数为25.2,经PAGE电泳鉴定得到单一蛋白条带,分子量约为63.3kDa。     

克鲁维酵母SK16.001 β-半乳糖苷酶的纯化工艺研究

采用不同分离手段纯化获得克鲁维酵母SK16.001中β-D-半乳糖苷酶。结果显示,通过硫酸铵分级盐析、透析脱盐、DEAE-fastflow离子强度梯度层析、Superdex G-75凝胶过滤后,酶的最终回收率为30.5%,纯化倍数为25.2,经PAGE电泳鉴定得到单一蛋白条带,分子量约为63.3kDa。      

马克斯克鲁维酵母的中试发酵研究

对马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）的细胞积累展开中试发酵,并且在其培养过程中研究菌体的生长情况以及呼吸参数和代谢产物的变化规律。结果表明,通过摇瓶和3 L发酵罐的分批培养,从6株马克斯克鲁维酵母中确定了马克斯克鲁维酵母菌株F#在生长方面更具优势。利用带有尾气分析仪的50 L发酵罐对菌株F#进行分批培养和流加培养,确定了菌株F#存在Crabtree效应。并且通过线上监测呼吸商（RQ）、发酵液pH和溶氧的变化情况,以合适的补料工艺减弱了菌株F#的Crabtree效应,培养12 h后细胞干质量达（54.37±3.3）g/L,实现了细胞的大量积累,对马克斯克鲁维酵母的工业生产具有一定指导意义。     

马克斯克鲁维酵母木薯乙醇发酵工艺研究

通过单因素试验对一株耐高温马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）HY32的木薯乙醇发酵工艺进行了研究。结果表明,HY32利用木薯发酵乙醇的最佳工艺条件为料水比1∶5（g∶mL）,发酵时间96 h,接种量11%,发酵温度40 ℃,液化时间1 h,液化温度95 ℃,液化酶添加量为20 U/g淀粉,糖化酶添加量为150 U/g淀粉,硫酸铵添加量6 g/L,初始pH=5.0。在此条件下,HY32发酵木薯酒精度可达8.90%vol,淀粉利用率与淀粉出酒率分别为87.120%和49.48%,残糖量为0.03 g/L。与未优化的初始发酵条件相比,发酵醪的酒精度提高了16.65%。     

乳酸克鲁维酵母乳糖酶性质的研究

采用单因素试验方法研究了乳酸克鲁维酵母乳糖酶的性质,该酶在pH值为6.0～8.4范围内比较稳定,酶作用最适pH值在6.4～6.6;最适反应温度为45℃,并具有良好的热稳定性;Mn2＋,Mg2＋,Na＋等对酶有明显的激活作用,而重金属离子如Zn2＋和Cu2＋等对酶活有抑制作用。实验测定得该酶以ONPG为底物的米氏常数为3.348mmol/L。     

酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)原生质体形成与再生的影响。实验结果表明,原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒酵母菌龄9h,采用1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶,30℃酶解70min;马克斯克鲁维酵母菌龄8h,采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶,30℃酶解时间50min;配制酶液时渗透压稳定剂采用4%氯化钠高渗缓冲液,在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。     

马克斯克鲁维酵母原生质体制备和再生条件的研究

研究了菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度4个单因素对马克斯克鲁维酵母原生质体形成率和再生率的影响,采用菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度、稳渗剂进行5因素4水平的正交试验,分析各因素的极差值,评价各因素的影响程度。结果表明,酶浓度的极差值最高,其次为酶解时间,然后依次为菌龄、稳渗剂、酶解温度,酶浓度为影响原生质体形成的主要因素,原生质体形成和再生的最佳条件为：菌龄为12h,蜗牛酶浓度为1．5％,酶解时间为lh,酶解温度为28℃,稳渗剂为KCl,在此条件下,原生质体形成率为92．3％,再生率为29．6％。     

马克斯克鲁维酵母发酵产β-葡聚糖工艺优化

以马克斯克鲁维酵母为原料,研究马克斯克鲁维酵母发酵产β-葡聚糖的工艺。通过正交试验确定马克斯克鲁维酵母发酵产β-葡聚糖的培养基最佳配比,即葡萄糖用量为3.0%,酵母膏用量为2.5%,蛋白胨用量为1.0%,吐温-80用量为0.3%。以确定的最佳培养基,通过响应面分析法确定马克斯克鲁维酵母产β-葡聚糖的最佳发酵条件,接种量为5.2%,装瓶量31.3%,p H为5.1,发酵温度为31.9℃,β-葡聚糖得率达到6.03%。     

马克斯克鲁维酵母固态发酵菊粉酶培养条件的优化

在单因素试验基础上,为进一步提高马克斯克鲁维酵母固态发酵产生的菊粉酶的活力,采用全因子试验设计和中心组合设计对影响的因素进行优化,运用响应面分析模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,优化的培养条件为：菊芋粉3．62％,玉米浆干粉2．40％,培养温度28．13℃。模型预测的最大响应值为314．71U／gds,在优化条件下酶活为316．35U／gds,二者基本一致。     

马克斯克鲁维酵母发酵苹果酒的化学成分与抗氧化活性

近年来,由于非酿酒酵母属酵母发酵能够产生更多的风味物质,备受酿酒师的青睐。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种食品安全级的非常规酵母,可用于生产生物酶、木糖醇和芳香化合物等。该研究以Saccharomyces bayanus SAF作为对照,通过发酵苹果酒的化学成分和抗氧化活性对比分析,研究了K.marxianus酿造苹果酒的特征。在25～35℃条件下,K.marxianus能够在96 h内完成乙醇发酵,产量约56.8 g/L。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(head space-solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)分析结果表明,K.marxianus发酵产生的乙酸-3-甲基-1-丁酯、辛酸乙酯、己酸乙酯等酯类物质的均高于S.bayanus。2种苹果酒液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)分析鉴定出41种抗氧化成分,其中K.marxianus苹果酒的总...     

马克斯克鲁维酵母对发酵乳中糖代谢的影响

采用高效液相色谱等方法,对乳酸菌单独发酵和向其中添加马克斯克鲁维酵母这两种发酵乳中乳糖代谢主要产物及关键酶活力的变化情况进行对比分析,以确定添加酵母菌对乳糖无氧代谢产生乳酸途径的影响。结果表明：添加酵母菌后乳糖降解速率明显加快（P＜0.05）,贮藏期间马克斯克鲁维酵母可以对积累的半乳糖进行利用;发酵过程中,由于酵母菌的添加使β-半乳糖苷酶及乳酸脱氢酶活力有显著提高（P＜0.05）,糖酵解途径关键限速酶--己糖激酶和丙酮酸激酶活力增加（P＜0.05）;含有酵母菌的发酵乳pH值下降（滴定酸度上升）较乳酸菌单菌发酵快（P＜0.05）,这与添加酵母菌后发酵乳中乳酸含量显著增加（P＜0.05）有关;丙酮酸含量变化不显著（P＞0.05）。该研究揭示了马克斯克鲁维酵母的添加对乳糖酵解具有一定促进作用。     

利用重组大肠杆菌和马克斯克鲁维酵母高效催化合成D-阿洛酮糖

提出了一种高效、低成本的两阶段生产D-阿洛酮糖的生产工艺。第一阶段,构建异源表达Flavonifractor plautii D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组大肠杆菌用于转化果糖,实现D-阿洛酮糖的全细胞生物合成。重组大肠杆菌在pH 7.5、65℃条件下反应最优,且在不添加金属离子、60℃反应条件下半衰期达到2.7 h,具有高热稳定性。在添加干重2.4 g/L重组大肠杆菌的D-果糖纯水溶液中,产物D-阿洛酮糖的终质量浓度为231 g/L,转化率达到33%。在添加硼酸根离子的条件下,D-阿洛酮糖的终质量浓度为378 g/L,转化率可以达到63%。在第二阶段,利用马克斯克鲁维酵母消耗混合体系中的D-果糖生产乙醇,降低分离成本。在不添加任何营养物质的情况下,在2种不同体系内,D-果糖均可以完全被消耗并产出约0.4 g/g的乙醇。该文研究结果为D-阿洛酮糖的低成本工业化生产奠定了良好的基础。     

马克斯克鲁维酵母生物转化2-苯乙醇工艺优化及耐高温特性分析

以耐高温的马克斯克鲁维酵母LY1为试验菌株,通过单因素试验和响应面法分析培养基主要成分L-苯丙氨酸、碳源、氮源等对天然香料2-苯乙醇合成的影响,优化结果为:L-苯丙氨酸8.39 g/L,蔗糖43.25 g/L,酵母浸粉6.68 g/L,2-苯乙醇产量达到1.450 g/L,较优化前提高了51.0%。进一步对LY1菌株进行耐受性能和高温发酵性能分析,结果表明,36℃时对2-苯乙醇耐受的质量浓度为2.0 g/L,42℃高温时为1.5 g/L,合成2-苯乙醇的最佳温度范围为28~32℃,42℃时2-苯乙醇产量为0.809 g/L。     

马克斯克鲁维酵母高密度发酵条件的优化研究

对影响马克斯克鲁维酵母高密度发酵的培养基营养成分和培养条件展开分析研究。单因素实验发现,YPD作为基础培养基有利于马克斯克鲁维酵母的增殖;培养基成分响应面分析和培养条件正交实验结果表明,当培养基成分为蔗糖67.37 g/L,酵母浸粉29.7 g/L,玉米浆15.61 g/L,KH₂PO₄4.13 g/L,MgSO₄0.3 g/L,初始pH为6.0、发酵温度为30℃、搅拌速度为160 r/min时,发酵培养18 h马克斯克鲁维酵母的生物量最大,为（9.34±0.12）g/L。进一步进行乳饮品发酵实验,优化培养的马克斯克鲁维酵母与乳源培养基培养的马克斯克鲁维酵母,在菌种的生物量和乳饮品的口感风味上无明显差异。因此,优化后的高密度发酵培养基配方和工艺条件适宜于马克斯克鲁维酵母菌的高密度发酵。      

产β-D-半乳糖苷酶马克斯克鲁维酵母的分离鉴定及其产酶特性

从藏灵菇中分离筛选到的一株高产β-D-半乳糖苷酶菌株ZX-5,经ITS DNA序列分析,鉴定为马克斯克鲁维酵母。对产酶培养基的最佳碳源和氮源优化结果为半乳糖2.0%,胰蛋白胨1.0%;产酶优化条件:温度30℃,培养基初始pH 6.5,装液量30%,转速100 r/min,接种量2.0%,发酵36 h。粗酶液酶活力为2.60 U/mL;经硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析,获得纯化酶的比活力为157.35 U/mg。酶最适反应温度35℃,最适pH 6.0,在20～40℃和pH 5.0～7.0的范围内酶的稳定性较好;Mn2+对酶的活性有促进作用。利用菌株ZX-5β-D-半乳糖苷酶分解乳糖并合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,GOS),在35℃、乳糖质量浓度60 g/100 mL、酶浓度1.0 U/mL条件下,乳糖水解率达68.34%(50 h),GOS产率达34.70%(40 h),具有潜在的应用前景。     

马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵对液态法黄酒风味的影响

以糯米糖化液为发酵基质,对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)HY32在不同发酵温度、不同通气条件以及与酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)TRADY混合发酵对黄酒风味物质和感官的影响进行了研究.结果表明,HY32在37℃下发酵的黄酒的乙醇体积分数为7.13％,是28...