重组牛凝乳酶原与重组单峰驼凝乳酶原活化速率的初步比较

原核表达的重组牛凝乳酶原与重组单峰驼凝乳酶原,包涵体经溶解和复性后,酸化/中和处理获得成熟凝乳酶。酸化/中和处理两种酶原时发现二者的活化速率有明显差别。相同条件下,牛凝乳酶原在2h以内即可完全活化,而单峰驼凝乳酶原需3d以上。将牛凝乳酶propeptide序列部分或全部取代单峰驼凝乳酶原相应序列,并构建到相同原核表达载体进行表达与复性,获得的融合蛋白MUT-1和MUT-2经酸化/中和处理,MUT-1在p H 2.0~8.5范围均不能活化,MUT-2的活化情况与单峰驼凝乳酶原相同。这也暗示酶原的激活不仅涉及propeptide与酶活性部位的静电作用,还可能与凝乳酶的结构或酶活相关。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。     

重组凝乳酶原在大肠杆菌中的表达及活性研究

为了提高干酪生产中起重要凝乳作用的凝乳酶的原核表达效率,分析了Genbank中牛、羊和骆驼凝乳酶原(prochymosin,pCHY)的保守序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,合成了凝乳酶原序列,并将其克隆至大肠杆菌原核表达载体上。经IPTG的诱导得到高效表达的凝乳酶原;Western blotting检测证明了其具有免疫原性;经pH值2到6活化后成功自剪切,得到大小约36 ku的有凝乳活性的凝乳酶。研究获得较高表达水平具有凝乳活性的重组凝乳酶。     

牛凝乳酶原基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶(chymosin,B-chy),用电脉冲法将线性化的pGAPZαA-B-pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS-PAGE分析表明所表达的牛凝乳酶,分子量约为37ku,符合预期大小。发酵培养96h后,酶活力达到96SU/mL。酶学特性分析表明,其最适凝乳温度为60℃,在pH2~6、小于50℃的温度范围内稳定。Ca2+浓度为40mmol/L时,钙促酶反应活性达到最高,此后随着Ca2+浓度的增加酶活力逐渐降低。金属离子Al3+、Mn2+、Fe2+、Mg2+和K+对酶活力具有显著的促进作用,而Co2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+对酶活力具有显著的抑制作用。本研究优化了凝乳酶的表达条件,为凝乳酶工业化生产提供了理论基础。     

原核表达重组牛凝乳酶的纯化

原核表达获得的重组牛凝乳酶与商品重组牛凝乳酶有相似的酶学特性,具商业潜力,故进一步研究其纯化方法。使用离心与饱和硫酸铵沉淀,成功纯化出有活性的重组牛凝乳酶。蛋白最终回收率为1.82%,总活力比纯化前提高了73.3%,比活力提高了95.3倍。同时,讨论了如何提高包涵体复性率与产物回收率,为今后该酶的工业化生产提供技术参考。     

重组凝乳酶的酶学特性研究

对重组毕氏酵母菌分泌表达的凝乳酶进行酶学特性研究.结果表明,该酶最适凝乳温度为45℃;最适pH值为5.0;在45℃以下可以保持相对稳定的活力,55℃(6 min)丧失全部活性;酶在4.0～7.0之间凝乳活性稳定;该酶在押肽酶、亮抑酶肽、苯甲基磺酰氟、1,10-菲咯啉等蛋白酶抑制剂的作用下均保持了大部分的活性,浓度为1μmol/L胃蛋白酶抑制剂Pepstain A可以明显抑制重组凝乳酶的活性.研究结果证明了重组凝乳酶与商品凝乳酶酶学特性相近,可以应用于干酪生产.     

重组微小毛霉凝乳酶的分离与纯化

用硫酸铵分级沉淀分离提取重组微小毛霉凝乳酶(GS115/pPICZαA-Mucor pusillus rennet),经过Sephadex G-75分子筛和DEAE-52离子交换2次柱层析纯化,酶的比活力由2078U/mg提高为10526U/mg,纯化倍数超过5倍,纯化的重组凝乳酶经SDS-PAGE电泳分析纯化的重组凝乳酶分子质量约为46kDa。     

重组牛凝乳酶基因在Bacillus megaterium WH320中的表达及其酶学性质研究

对牛凝乳酶基因进行密码子优化,并首次在高效表达宿主巨大芽孢杆菌中表达。通过克隆牛凝乳酶基因,将片段与穿梭质粒pHIS1525连接,连接产物转化大肠杆菌XL-10,筛选出阳性克隆子,所获重组质粒经酶切、测序鉴定,证实含目的片段。通过原生质体转化的方法转化到表达宿主巨大芽孢杆菌WH320。用木糖诱导表达,离心取上清经镍柱亲和层析(Ni-NTA)和聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离纯化并鉴定,测定重组牛凝乳酶的酶学性质,表明在巨大芽孢杆菌中得到有效表达。为我国利用生物工程技术的方法自主生产凝乳酶提供了基础。。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性

为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶(I3EB99)的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21(DE3)表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化,并利用生物信息学方法研究凝乳酶的三维空间立体结构。结果表明,重组表达的甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度为0.7 mg/mL,凝乳活力为(15 870±1.17)SU/g,蛋白水解活力为(263.81±0.94)U/g,凝乳活力与蛋白水解活力比值为60.16,符合干酪生产加工的要求。结构特性研究表明,经重组表达后的甲醇芽孢杆菌凝乳酶呈现疏水特性,具有跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋少于β-折叠,在分离纯化过程中结构不稳定易降解,该凝乳酶与来自甲醇芽孢杆菌的一种未知蛋白酶是同源蛋白,高级结构与PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A相似度最高。通过对甲醇芽孢杆菌凝乳酶结构特性的研究,为深入分析该凝乳酶作用机理及其功能性奠定了理论基础。     

重组人乳铁蛋白抗氧化活性研究

目的考察重组人乳铁蛋白自身及其在奶粉中的抗氧化活性。方法通过二苯代苦味肼基(DPPH)自由基抑制率、羟基自由基抑制率、超氧阴离子自由基抑制率、还原能力和抑制大鼠肝脏体外脂质过氧化等试验评价重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的体外抗氧化性能。结果重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白的浓度与DPPH自由基抑制率、抑制羟基自由基能力、抑制超氧阴离子自由基能力和还原能力之间呈明显剂量-效应关系,且差异有统计学意义(P0.05);样本和浓度之间没有交互作用,重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白在不同浓度下所得值的趋势相同。重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白在对大鼠肝组织匀浆抗氧化性影响差异有统计学意义(P0.05),不同浓度乳铁蛋白之间差异有统计学意义(P0.05)。结论重组人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白具有一定的抗氧化活性,可以添加到保健品或者化妆品中作为天然抗氧化剂。     

Welfare effects of the use of recombinant bovine somatotropin in the USA

The welfare effects of increased milk production associated with the use of recombinant bovine somatotropin (rBST) on dairy operations in the USA were examined for 1996. Results that derived from three different estimates of the milk-production response to rBST were evaluated and compared. One estimate, derived from a survey of dairy producers in Connecticut, led to economic-impact estimates that were not statistically significant. A second, derived from a national survey that concentrated on the health and management of dairy cattle, led to estimates that were unbelievably high. A third, derived from a national survey that concentrated on the economics of dairy producers, provided the most reasonable estimates of economic impacts. Results of economic analysis, using the latter results, indicated that if rBST had not caused milk production to increase, then the market price of milk would have been 2.2 +/- 1.5 cents/kg higher, and the total value of the milk produced would have risen from Dollars 23.0 +/- 0.6 billion to Dollars 24.1 +/- 1.0 billion. A welfare analysis demonstrated that the increased milk production (and the reduced market price) associated with the use of rBST in the USA caused the economic surplus of consumers to rise by Dollars 1.5 +/- 1.0 billion, while the economic surplus of dairy producers fell by Dollars 1.1 +/- Dollars 0.8 billion. Increased milk production associated with rBST yielded a total gain to the US economy of Dollars 440 +/- 280 million. An analysis of annual percent changes in the number of dairy cows per operation, milk production per cow, total milk production, total number of dairy cows, and total number of dairy operations in the USA suggested that the dairy industry's long-term economic growth path was stable from 1989-2001 inclusive, and did not receive a shock resulting from the introduction of rBST.     

冷冻蓝圆鯵鱼糜蛋白重组技术研究

以鱼糜蛋白质凝胶形成3个阶段理论为基础,从蛋白重组角度理论上分析添加剂在冷冻蓝圆鯵鱼糜生产过程中增强凝胶强度的作用机理,同时也通过测定凝胶强度对理论解释加以验证。研究还创新性的应用一种新型凝胶增强剂GRA1,可快速加强蛋白质分子结合力,促使大分子网络的数量增多,从而提高了鱼糜凝胶强度。GRA1克服了TG酶由于价格和不宜冻藏的因素导致其应用受到限制的缺陷,可在使用冻藏原料生产高品质鱼糜上推广应用。     

重组毕赤酵母中腺苷甲硫氨酸的纯化

腺苷甲硫氨酸(S-Adenosy-L-methionine,SAM)是人体中重要的中间代谢物,具有重要的生理功能。从重组毕赤酵母中生产SAM是一个有应用潜力的方式。该研究报道了一个完整的从具有重组SAM合成酶的毕赤酵母中纯化SAM的工艺。首先利用1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸的混合溶液破碎细胞,然后利用弱酸性阳离子大孔树脂吸附SAM,最后以流速为0.2 m L/min的100 mmol/L的硫酸洗脱SAM。SAM的收率达到80.03%,纯度为92%。     

重组人源胶原蛋白的分离纯化及其结构表征

采用巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/p PIC9KG6进行高密度发酵,获得细胞外分泌型重组人源胶原蛋白(recombinant human-source collagen,RHSC)。SDS-PAGE电泳分析证明:RHSC具有确定的分子质量,分别约为56 k Da的蛋白单体与112 k Da的二聚体。实验中运用透析法、盐析与柱层析结合法对工程菌的发酵上清液进行纯化,结果如下:(1)透析法——最佳条件为4℃,透析24 h,RHSC单体与二聚体混合物回收率接近100%,纯度82.5%。(2)盐析-柱层析结合法——发酵上清液通过40%饱和度硫酸铵沉淀与Sephadex G100纯化后获得二聚体,达到了电泳纯。通过DSC、紫外光谱、红外光谱与核磁共振波谱对分离纯化得到的RHSC进行结构表征,与标准Ⅲ型胶原蛋白比对,确定RHSC具有Ⅲ型胶原蛋白的特征结构。     

重组人EC-SOD包涵体的复性

目的将E.coli中表达的人胞外超氧化物歧化酶(hEC-SOD)包涵体进行复性.方法分离包涵体,用8mol/L尿素溶解后进行透析复性.结果包涵体蛋白可以部分复性,比活达到900U/mg protein.结论透析复性法可以复性EC-SOD包涵体.     

利用重组大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸

L-茶氨酸是茶叶中一种独特的非蛋白质氨基酸。γ-谷氨基甲酰胺合成酶可以催化L-谷氨酸、乙胺和ATP合成L-茶氨酸,但反应成本较高。为了提高L-茶氨酸的生产效率,该研究开发了直接发酵生产L-茶氨酸的新方法。首先,在大肠杆菌基因组上双拷贝Methylovorus mays来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas,获得了一株遗传稳定的用于L-茶氨酸生产的重组菌株。其次,在5 L罐中采用流加乙胺的方式发酵20 h,L-茶氨酸产量达到30. 45 g/L,糖酸转化率达到20.17%。最后,根据L-茶氨酸的物化性质拟定出合适的分离提取路线,从发酵液中获得了98.51%纯度的L-茶氨酸成品,总提取收率可达到70.34%。该方法操作简单,原料成本较低,具有较好的工业应用前景。