β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)β-1,3-1,4葡-聚糖酶基因序列,设计特异性引物,以提取的解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),将此目的基因克隆至pTG19-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠。序列比较发现,此片段与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefacines,M15674)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis,AY365256)分别有99%、95%和94%的同源性。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及基因克隆表达

为获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株,以高地芽孢杆菌YC-9为出发菌株,通过亚硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)和低能N+束诱变育种,筛选和选育得到两株突变株N-2-2和10-30s-3,发酵培养60 h,酶活力分别达到28.6 U/m L和36.1 U/m L,分别是出发菌株的2.36倍和2.98倍,与YC-9菌株相比,突变菌株菌体生长下降但发酵产酶量增加。进一步将β-1,3-1,4-葡聚糖酶克隆并在大肠杆菌中成功表达,经过30℃诱导6 h后,胞内酶活力达79.2 U/m L,为出发菌株的6.5倍。     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及酶学性质

首先根据Thermopolyspora flexuosa的内切-1,4-β-木聚糖酶基因设计了引物,PCR扩增成功后进行酶切消化,连接载体质粒pHT43,经大肠杆菌DH5α扩增后,挑选阳性克隆,经菌体PCR及测序验证后,将基因序列测序正确的质粒大量抽提,经过转化导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilius WB800N宿主,培养并经过1 mmol/L IPTG诱导表达后,发酵胞外上清经SDS-PAGE电泳证明重组蛋白质成功获得表达。其相对分子质量为27 kD,最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.0。由此得知,分泌表达的嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌株构建成功,这为未来该酶的产业化生产奠定了基础。     

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。     

耐高温β-葡聚糖酶产生菌株的筛选及酶学性质的研究

从云南安宁温泉周围土壤中筛选到1株热稳定性能较好的β-葡聚糖酶产生菌W-9.其发酵条件及酶学特性为:发酵 72h,在pH6.0、70℃条件下,酶活性为82.64u/mL.分子生物学及其生理生化鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).W-9产β-葡聚糖酶的酶学性质结果显示,其产β-葡聚糖酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,在70℃条件下保温时,酶活基本稳定.     

产β-葡聚糖酶高产菌株的驯化及筛选

根据刚果红与β-1,3、β-1,4-葡聚糖紧密结合而保持红色的特征,筛选β-葡聚糖酶高产菌株.本实验室保存的黑曲霉QYW-01经紫外诱变和产酶驯化,获得一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉QYW-01A06,在摇瓶条件下发酵液酶活力达2642U/mL,是出发菌株的2.4倍.     

拟青霉WPG-1的鉴定及固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件的优化

从土壤中筛选出一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的耐热真菌WPG-1,经过鉴定为拟青霉属(Paecilomyces sp.)。通过单因素试验优化拟青霉WPG-1固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。结果表明,该菌株产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最佳条件是:以燕麦粉为碳源,蛋白胨为氮源(氮素含量0.2%),初始水分含量70%,初始p H为自然,培养温度45℃为最佳产酶条件。在优化后的条件下培养5 d产β-1,3-1,4-葡聚糖酶水平高达1 324.49 U/g干基碳源。     

微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质和基因工程研究进展

对微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质,基因克隆和表达等方面研究进展作了综述.     

5,6-二氢-1,3,5-二噻嗪类食用香料研究进展

5,6-二氢-2,4,6-三取代基-1,3,5-二噻嗪是一类重要的含硫含氮杂环香料化合物,目前从食品中鉴定出的已经有70种左右。由于这类香料化合物具有典型的烤香、肉香、坚果香、蔬菜香等香气特征,有的已经被我国及世界上多个国家批准用来调配食用香精,用于食品加香,如2,4,6-三甲基-5,6-二氢-4H-1,3,5-二噻嗪、2(4)-异丁基-4(2),6-二甲基-5,6-二氢-4H-1,3,5-二噻嗪、2,4-二甲基-4H-吡咯[2,1-d]-1,3,5-二噻嗪等。本文对67种5,6-二氢-2,4,6-三取代基-1,3,5-二噻嗪类香料化合物的天然存在和香气特征进行了归纳;由于在食品基质中这类化合物的形成与多种因素有关,如梅拉德反应、脂肪的氧化、Strecker降解、pH、温度等,因此有必要对其在食品热加工过程中的形成机理进行研究和总结;考虑到1,3,5-二噻嗪类化合物在香料工业中的潜在价值,本文也对文献报道的该类化合物的合成方法进行了概括。     

2-对甲氧基苯基-5-对硝基苯甲酰胺基-1,3,4-噻二唑合成与表征的研究

利用生物等排原理和亚结构连接法,对噻二唑的母体进行修饰,合成了新的化合物5-对甲氧基苯基-2-对硝基苯甲酰氨基-1,3,4-噻二唑。研究了温度对目标化合物合成得率的影响,并对其结构进行IR谱图分析。     

由α-蒎烯合成甜味剂1,8-对(艹孟)二烯-7-肟

本文讨论了以松节油为原料采用微波辐照相转移化技术和“一锅煮”等新技术合成1,8-对二烯-7-肟的方法和工艺技术条件,并对产品进行物理性质和Uv、IR、MS等的测定。结果表明,采用本法总收率可达到62.3%。     

Characterization of the sec1-1 and sec1-11 mutations.

Sec1 proteins are implicated in positive and negative regulation of SNARE complex formation. To better understand the function of Sec1 proteins we have identified the nature of the temperature-sensitive mutations in sec1-1 and sec1-11. The sec1-1 mutation changes a conserved glycine(443) to glutamic acid. The sec1-11 mutation changes a highly conserved arginine(432) to proline. Based on homology and the crystal structure of the mammalian nSec1p, the corresponding amino acids localize to the 3b domain of nSec1p. Compared to the wild-type Sec1p the mutant proteins are less abundant even at the permissive temperature. Thus, the R432P and G443E mutations may cause structural alterations that affect folding and make the mutant proteins more susceptible to degradation. The remaining part is sufficient for growth and protein secretion at 24 degrees C and thus is likely to be properly folded. At 37 degrees C the mutant proteins become non-functional. In pulse-chase-type experiments the newly synthesized Sec1-1 and Sec1-11 proteins decayed similarly with the wild-type protein. Thus, the non-functionality of the mutant proteins cannot be explained by denaturation-induced degradation only. It is possible that the newly synthesized mutant proteins fold slowly and are susceptible to degradation before they have managed to fold and associate with other proteins. The mutant proteins were unable to interact with the Sec1p-interacting proteins Mso1p and Sso2p in the two-hybrid assay, even at the permissive temperature. These results localize sec1-1 and sec1-11 mutations to a domain of Sec1p and suggest a mechanism by which sec1-1 and sec1-11 cells become temperature-sensitive.     

贝莱斯芽孢杆菌1-3产表面活性素的纯化、鉴定及表征

从口腔离体牙样品中筛选得到1株具有抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）1-3。通过硫酸铵沉淀、分子筛层析、薄层层析和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱检测,确定具有抑菌活性的物质是含有14～16个C的环状脂肽Surfactin,其分子质量分别为1 030.642、1 044.660 Da和1 058.677 Da。通过对分离纯化Surfactin的特征研究,结果表明其具有表面活性剂的功能,对食品加工、医疗卫生、畜禽养殖中常见的病原菌具有抑制作用,其中对单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115的最小抑菌浓度可达4 μg/mL。Surfactin对小鼠红细胞在有效抑菌浓度范围内未显示溶血性,且具有良好的热稳定性（20～100℃）和广泛的pH值（2.0～10.0）适应性,表明其在食品加工、医疗卫生和畜牧养殖中具有良好的应用潜能。     

实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系的鉴定方法。方 法：以转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2为研究对象,在转基因小麦外源片段与小麦染色体重组的边界序 列分别设计引物和探针,以其他多种转基因产品和非转基因小麦为对照进行特异性实验,以B73-6-1样品模拟制备 10 个含量梯度的添加样品进行灵敏度实验。结果：本研究设计的引物和探针具有很好的品系鉴定特异性,检测灵敏 度可达到0.01%（m/m）。结论：该方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确地鉴定转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b 和B102-1-2品系。