β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

在大肠杆菌中实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达。将实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)进行融合连接到p ET-28a(+)上;通过优化诱导表达条件,28℃、8 g/L乳糖诱导10 h,重组菌E.coli BL21/p ET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/m L,与IPTG诱导的重组菌E.coli BL21/p ET-bgl(583 U/m L)相比,提高了0.87倍。本研究为高密度发酵制备该酶奠定了基础。     

海洋细菌低温葡萄糖氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为解决细菌葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)活力较低的问题,提取和纯化了实验室保藏海洋细菌Citrobacters sp. 8-III的基因组DNA,并与现存GOD基因比对获得目的序列,以此序列为模板获得GOD基因。将人工合成并密码子优化的GOD基因亚克隆至载体p ET28a(+),构建重组表达载体p ET28a(+)-GOD并转化到E. coli BL21(DE3)中实现表达。经镍柱亲和层析得到较纯的重组GOD,并对其进行酶学性质研究。实验成功构建了产GOD的E. coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-GOD,目的蛋白约46 k Da。重组GOD酶活为2. 04 U/m L,该酶最适作用温度为25℃;最适作用p H为6. 0; K~+、Ni~(2+)对GOD的活性有明显促进作用;重组GOD添加至饲料中可加快雏鸡生长,且具备一定防腐功效。该研究首次将海洋细菌GOD基因导入大肠杆菌中,开拓GOD外源表达新的宿主。同时重组GOD具备低温酶特性,为其在饲料添加剂和低温领域应用奠定了基础。     

耐热木聚糖酶基因xyn11EM在大肠杆菌中的表达

将人工合成经密码子优化的11家族耐热木聚糖酶基因xyn11~(EM)克隆至表达质粒p ET-28a(+)中,获得重组质粒p ET-28a-xyn11~(EM)。将其转化Escherichia coli BL21(DE3),构建表达耐热木聚糖酶的重组工程菌E.coli BL21/xyn11~(EM)。用IPTG诱导表达重组木聚糖酶Xyn11~(EM)(re Xyn11~(EM)),酶活性可达47.5 U/m L。SDS-PAGE分析显示,re Xyn11~(EM)的表观相对分子质量为24 800。re Xyn11~(EM)的最适反应温度为70℃,在70℃以下稳定。最适反应p H为6.5~7.0,在p H5.0~8.0范围内稳定。大多数金属离子和EDTA对该重组酶的活性影响不大。re Xyn11~(EM)的Km和Vmax值分别为7.2 mg/m L和54.7 U/mg。结果表明xyn11~(EM)成功在E.coli中实现了异源表达,其良好的热稳定性具有较好的工业应用潜力。     

超表达葡萄糖脱氢酶促进大肠杆菌生长

通过PCR扩增了肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠杆菌(Escherichia coli)各自的葡萄糖脱氢酶基因KPgdh和ECgdh,构建了表达载体p ET-28a-KPgdh和p ET-28a-ECgdh,转化大肠杆菌E.coli BL21,获得了重组菌BL21(p ET-28a-KPgdh)和BL21(p ET-28a-ECgdh)。经IPTG诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组菌实现了葡萄糖脱氢酶的高效表达,且葡萄糖脱氢酶活性分别是空质粒对照菌E.coli BL21(p ET-28a)的8.5倍和12倍。重组菌的生长速度快于空质粒对照菌E.coli BL21(p ET-28a),并与原代菌E.coli BL21持平。如果扣除质粒复制造成的代谢负荷,过表达葡萄糖脱氢酶促进了大肠杆菌的生长。     

粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1在大肠杆菌中的分泌表达及其条件优化

克隆粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因pla A,与载体p ET-22b(+)连接构建重组质粒p ET-22b(+)-pla A,并将重组质粒导入受体菌E.coli BL21(DE3)中表达,构建得到重组菌AP22,IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析显示:重组蛋白以可溶性蛋白的形式大量存在于发酵液中,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。以磷脂酶A1酶活为指标,在单因素实验的基础之上,通过正交实验得到摇瓶培养最佳条件为:氨苄青霉素终浓度30μg/m L,IPTG加量0.25 mmol/L,温度为34℃,OD600值为0.3,诱导时间4 h。在此条件下重组胞外磷脂酶A1酶活可高达8.6 U/m L,比优化前提高了43.3%。     

杨氏柠檬酸杆菌磷脂酶A1基因在E.coli中的表达

为实现磷脂酶A1(PLA1)的异源表达,将杨氏柠檬酸杆菌(CICC No.21596)PLA1基因插入载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET28a(+)-pla1,并将重组质粒转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,获得重组菌p ET28a(+)-pla1/DE3。在IPTG诱导作用下经SDS-PAGE检测,发现在重组菌发酵破碎上清液中存在33 000大小的蛋白质,与预期蛋白质大小相符。在硼砂卵黄平板上对重组菌PLA1活性进行检测,结果显示重组菌具有明显的PLA1活性,表明PLA1基因在大肠杆菌中得到了表达。经发酵初步优化,获得摇瓶发酵的最佳诱导表达条件为:转接体积分数4%、诱导时机2 h、IPTG终浓度为0.4 mmol/L、37℃诱导培养8 h。经酸碱滴定法测得最高酶活为(5.6±0.2)U/m L。     

重组大肠杆菌产腈水解酶的培养条件优化

以产腈水解酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-NIT为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立5 L发酵罐上重组大肠杆菌产腈水解酶的高密度发酵工艺。通过分批补料培养工艺优化,表明碳、氮源的浓度以及诱导剂的浓度和诱导时机是影响菌体生长和酶活的重要因素。在优化条件下,对E.coli BL21(DE3)/pET-28b-NIT进行14 h的分批补料培养,菌体细胞浓度为13.7 gDCW/L,较优化前提高了4.3倍;腈水解酶体积酶活为36 990 U/L,较优化前提高了5.1倍。     

双歧杆菌源亚油酸异构酶的原核表达及功能分析

来源于短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase, BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源单酶转化亚油酸生成共轭亚油酸c9,t11-CLA单体的亚油酸异构酶。该文以pET-28a(+)为表达载体，构建组氨酸标签分别位于C端和N端的重组载体pET-28a(+)-bbi-His和pET-28a(+)-His-bbi,分别实现其在BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS和Rosetta(DE3) 3种类型的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主中的异源表达和条件优化。结果表明表达BBI的最优重组菌为E.coli Rosetta/pET-28a(+)-bbi-His,最佳诱导条件为以1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导8 h,且当用BBI粗酶转化脂肪酸时，相较于亚油酸和γ-亚麻酸，BBI更偏好转化α-亚麻酸。     

重组蔗糖异构酶的制备及应用条件优化

对重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-pal I摇瓶发酵产酶进行研究,探讨了3 L发酵罐中不同乳糖诱导浓度对菌体高密度发酵产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵得到胞外上清酶活253.1 U/m L,3 L发酵罐高密度发酵时,在0.4 g/(L·h)乳糖诱导浓度下,发酵上清酶活可达到最大值654 U/m L。对重组蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖的酶转化条件进行了优化,结果表明,当底物浓度为400 g/L,反应初始p H 6.5,温度30℃,加酶量20 U/g蔗糖,转化时间8 h,异麦芽酮糖可以达到最大转化率87.9%。     

裂殖酵母醛酮还原酶基因的克隆与诱导表达条件优化

从裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)基因组中克隆获得编码醛酮还原酶SpoAKR3C2的基因,并成功构建了表达SpoAKR3C2的重组工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)/pET 28bSpoAKR3C2.为了提高SpoAKR3C2在E.coli BL21(DE3)中的表达水平,分别考察了种子液接种量、诱导时间、温度、转速以及诱导剂浓度等对产醛酮还原酶SpoAKR3C2的影响.结果表明:该酶的最适诱导温度为19℃,最适转速为140r/min,最适诱导时间为14h,最适接种量为1.5%(体积比).以IPTG为诱导剂,最适诱导剂浓度为0.1 mmol/L.在最佳诱导条件下,粗酶液中SpoAKR3C2对酮基泛解酸内酯的比酶活可达6.762U/mg,与未优化前相比提高了3.4倍.