基于宏基因组的烟田土壤细菌群落结构和功能分析

为探讨健康和易感病烟田土壤微生物群落结构及其功能,以凉山彝族自治州连作10年的1块健康和2块易感病（黑胫病、青枯病和根腐病）烟田为研究对象,利用宏基因组技术分析土壤细菌群落结构。结果表明：健康和易感病烟田的土壤细菌群落结构具有明显差异。烟田土壤中相对丰度大于4%的优势菌门有放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）。健康烟田土壤中优势有益菌属链霉菌属（Streptomyces）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和分枝杆菌属（Mycobacterium）的相对丰度极显著高于易感病烟田。易感病烟田土壤中潜在病原菌罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）的相对丰度极显著高于健康烟田。健康烟田土壤中蛋白酶活性显著高于易感病烟田。健康烟田土壤中碳代谢途径的关键酶基因丰度均高于易感病烟田;氮代谢途径中,健康烟田反硝化过程的酶基因丰度低于易感病烟田。因此,健康和易感病烟田土壤中细菌群落组成、酶活性及碳氮代谢过程中的关键酶基因丰度均存在不同程度的差异。     

万寿菊-烟草轮作调理植烟土壤细菌群落结构的作用

基于大田试验和Illumina Hiseq扩增子测序技术,分析了万寿菊-烟草轮作对植烟土壤细菌群落多样性和结构的影响,旨在为缓解烟草连作障碍提供理论依据。结果表明,万寿菊-烟草轮作可提高烟株根际土壤细菌群落Sobs、Shannon和Chao1等多样性和丰富度指数;提升土壤中酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度;促使生防菌(Pseudomonas)、功能菌(Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium)、降解菌(Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter)和根际促生菌(Flavisolibacter)等菌属比例上升,有利于改善土壤微生态环境、缓解连作障碍。     

客土改良对植烟土壤营养及烟草青枯病的影响

针对南雄烟区沙泥田烟草青枯病发病重的问题,采用大田试验方法,于植烟沙泥田耕层土壤中掺混了一定比例自然风化的红砂土(紫色土),研究了掺混后的土壤营养状况变化规律,并分析了沙泥田掺混红砂土对烟草青枯病的防治效果及原因。结果表明,在易发烟草青枯病的沙泥田耕层土壤中掺混红砂土150~450 m~3/hm~2后,土壤pH由酸性(4.78)渐变为中性(7.06),交换性钙离子含量增加了3~4倍,土壤中青枯病菌、细菌和真菌数量减少,而放线菌数量增加,青枯病发病率和病情指数比沙泥田分别下降了42.2%~73.5%和51.4%~81.1%。相关分析表明,pH、放线菌数量与青枯病发病率、病情指数均呈极显著负相关。在青枯病发病率高的植烟沙泥田耕层土壤中,掺混一定比例的红砂土可防治或减少烟草青枯病的发生。     

烟草青枯病发病烟株根际土壤细菌群落分析

  目的  研究青枯病发生对根际土壤细菌群落组成的影响, 探明影响根际土壤细菌群落的环境因子。  方法  采用宏基因组学高通量测序技术, 比较发病烟株和健康烟株根际土壤细菌群落差异。  结果  (1) 健康烟株根际土壤细菌Ace指数、Chao指数和Shannon指数有高于发病烟株的趋势, 而Simpson指数有低于发病烟株的趋势; (2)发病烟株根际土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)等益生菌减少, 而劳尔氏菌属(Ralstonia)和Rudaea等病原菌增加; (3)土壤pH、有效磷(AP)、交换性钙(Ca)和有效铜(Cu)含量在发病烟株根际土壤中显著减少, 而速效钾(AK)含量显著增加。  结论  与健康烟株根际土壤相比, 发病烟株根际土壤细菌多样性、有益菌丰度、土壤pH和养分含量都较低; pH、P、K、Ca、Cu是对根际土壤细菌群落影响较大的土壤环境因子。      

菌根烟苗的抗青枯病效应研究

利用漂浮育苗技术获得菌根烟苗,通过盆栽试验和病区大田试验,比较了菌根和非菌根烟苗移栽后的青枯病发病率、病情指数,以及接种青枯菌后烤烟根系几丁质酶活性变化。结果表明:菌根烟苗可推迟青枯病发病时间,降低发病率和病情指数,提高烤烟抗青枯病能力。原因可能是AM真菌与青枯菌争夺烤烟根系上的侵染位点,也与菌根烟苗几丁质酶活性的快速增加有关。      

万寿菊秸秆熏蒸对烟株根际土壤原核微生物群落的影响

为缓解烟草连作障碍,通过大田试验分析了万寿菊秸秆熏蒸对烟株根际土壤原核微生物群落的影响。结果表明,万寿菊秸秆(750～3 000 kg/hm~2)熏蒸可提高烟株根际土壤细菌和放线菌数量,1 500kg/hm~2用量时的效果最明显。1 500 kg/hm~2万寿菊秸秆熏蒸可提高烟苗移栽后50 d时土壤原核微生物群落Shannon多样性指数和Sobs、Chao1丰富度指数,增幅分别为6.09%、11.81%和11.27%。同时,1 500 kg/hm~2万寿菊秸秆熏蒸可改善土壤原核微生物群落结构,提高根际土壤中拮抗菌[鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、未确定属的芽单胞菌科(unidentified Gemmatimonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)]、降解菌(Ramlibacter)、功能菌[Candidatus Solibacter、Bryobacter、根微菌属(Rhizomicrobium)]和根际促生菌[黄色土源菌属(Flavisolibacter)]的相对丰度。因此,万寿菊秸秆熏蒸在缓解烟草连作障碍方面具有潜在作用。     

间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响

【目的】探究利用烤烟与小葱、苦苣和油麦菜三种植物间作缓解其连作障碍，为消除烟田土壤连作障碍提供参考。【方法】采用16S RNA高通量测序技术对间作烤烟烟株根际土壤（连作烤烟烟株根际土壤为对照）细菌群落结构组成进行测定分析；利用Tax4Fun功能预测获得相应样品细菌群落的生态功能。【结果】间作处理的烟株根际土壤细菌群落的OTU数、丰度和多样性均大于对照，与CK处理相比，小葱（T1处理）、苦苣（T2处理）和油麦菜（T3处理）间作处理的丰度分别增加了16.52%、12.10%、6.28%，而OTU总数分别增加了6.00%、0.65%、3.49%；在门水平上的6个优势菌群中，与CK的丰度相比，T1、T2、T3处理在变形菌门上分别提高了42.86%、17.85%和21.43%，厚壁菌门上分别提高了27.27%、0%和9.09%，酸杆菌门上分别提高了9.09%、27.27%和36.36%，放线菌门上T2处理提高了7.14%而T1和T3处理分别下降了28.57%和14.30%，拟杆菌门上T1处理提高了8.33%而T2和T3处理分别下降了16.67%和8.33%，芽单胞菌门上T1和T3处理分别下降了5...     

牡蛎壳粉对烟草根际土壤微生物代谢多样性及青枯病发生的影响

为揭示牡蛎壳粉等土壤改良剂对烟草根际土壤微生物代谢多样性及烟草青枯病发生的影响,通过田间试验,设置牡蛎壳粉、生石灰、草木灰和对照4个处理,研究了不同土壤改良剂对发病地块土壤pH和微生物群落代谢多样性的影响,以及对烟草青枯病的防控效果。结果表明,牡蛎壳粉可以显著提高土壤pH,增强土壤微生物对碳源的利用程度(AWCD),增加微生物代谢多样性(Shannon指数),同时提高土壤微生物群落内物种的均匀度(McIntosh指数)。主成分分析表明,烟草根际土壤微生物群落利用的主要碳源为羧酸类、氨基酸类和碳水化合物类,但不同土壤改良剂处理土壤微生物碳源利用特征存在差异。牡蛎壳粉处理后的地块烟草青枯病发病率最低,较对照降低43.33%。Pearson相关分析表明,土壤pH与土壤微生物代谢多样性指数呈正相关,而与发病率呈负相关。因此,施用土壤改良剂牡蛎壳粉可提高土壤pH和增加土壤微生物代谢多样性,进而提高土壤微生态环境的稳定性,对烟草青枯病起到较好的防控效果。     

接种丛枝菌根真菌对烟草青枯病抗性的影响

为探讨丛枝菌根真菌(Glomus intraradices和Glomus mosseae)对烟草青枯病抗病性的影响,采用盆栽试验研究了接种丛枝菌根真菌对烟草青枯病发病情况、抗病相关酶活性及丙二醛含量的影响。结果显示,接种Glomus intraradices和Glomus mosseae可促进烟草植株生长,烟株地上部和根系的干质量和磷含量以及地上部的氮含量显著增加,同时烟草青枯病的病情指数及发病率降低;在接种青枯菌条件下,与对照(烟株接种病原菌,但不接种丛枝菌根真菌)相比,接种Glomus intraradices和Glomus mosseae后,烟草叶片过氧化物酶活性分别增加22.9%和26.9%,同时丙二醛含量呈下降趋势。表明接种丛枝菌根真菌能提高烟株对烟草青枯病的抗性。     

黄腐酸与微生物菌剂协同对烟草青枯病及根际土壤细菌群落的影响

为研究黄腐酸与微生物菌剂协同对烟草青枯病及根际土壤细菌群落的影响,采用随机区组试验,调查了烟草青枯病田间发病情况,并对根际土壤样品中细菌16S rRNA基因的V4区进行扩增和高通量测序,分析各处理细菌群落结构。结果表明:(1)移栽120 d后,黄腐酸与微生物菌剂协同处理烟草青枯病发病率和病情指数显著降低。(2)黄腐酸与微生物菌剂协同处理可显著提高根际土壤细菌群落观测物种数(Observed_species)、香农指数(Shannon index)和辛普森指数(Simpson index)。(3)黄腐酸与微生物菌剂协同处理可改善根际土壤细菌群落结构,显著提高根际土壤中节杆菌属(Arthrobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和Bryobacter属的相对丰度,同时显著降低未确定属的伯克氏菌科(unidentified_Burkholderiaceae)、链霉菌属(Streptomyces)、未确定属的芽单胞菌科(unidentified_Gemmatimonadaceae)和戴氏菌属(Dyella)的相对丰度。黄腐酸与微生物菌剂协同对烟草青枯病有较好的防治效果,根际土壤细菌群落多样性显著增加,细菌群落结构发生明显变化。     

生物有机肥对烟草青枯病的防效及对土壤细菌群落的影响

烟草青枯病是一种危害严重的土传性病害,为了防治烟草青枯病,筛选了3株拮抗青枯雷尔氏菌的芽孢杆菌（甲基营养型芽孢杆菌JK3、枯草芽孢杆菌JK4和解淀粉芽孢杆菌JK10）,将其发酵液添加到有机肥中,经二次发酵后获得生物有机肥（SF2、SF4）,施入烟田。结果表明,生物有机肥能较好地防治烟草青枯病,同时促进烟株的生长,SF2、SF4处理的防效分别为82.18%、68.82%。同时,采用高通量测序技术分析了土壤细菌的群落结构,发现生物有机肥显著影响了土壤细菌的群落结构,促进了土壤中有益菌（如鞘氨醇单胞菌属、类芽孢杆菌属、耐热芽孢杆菌、梭菌属等）的增殖。芽孢杆菌和链霉菌的数量也明显增加,推测链霉菌和芽孢杆菌可抑制青枯雷尔氏菌的繁殖,进而控制烟草青枯病的发生。施用添加拮抗芽孢杆菌的生物有机肥是防治烟草青枯病的一项有效措施。     

有机肥施用对烟田土壤细菌多态性的影响

为实现烟田土壤保育的目标,对长年连作的烟田施用有机肥,采用高通量测序技术,应用Solexa基因组分析平台,测定和分析复合有机肥OFN、OFJ和烟草秸秆有机肥TS对烟田土壤细菌多态性的影响。结果表明,相对于单施化肥,烟田施用有机肥后,烟田土壤细菌OTU、chao1指数和ace指数增大,表明有机肥提高了烟田土壤细菌物种丰富度;细菌丰富度因有机肥种类而不同,并随烟草发育期而产生差异。有机肥对土壤细菌菌群结构影响显著,在门和属的分类水平上,土壤优势细菌种类和比例产生明显改变,特别是有机肥处理可显著提高假丝酵母属细菌的丰度,而降低红色杆菌属、硝化螺旋菌属细菌的丰度。KEGG代谢途径差异分析发现,施用有机肥后土壤细菌代谢路径和代谢路径中基因数量发生改变,而改变了烟田土壤细菌群落功能和细菌代谢。总之,烟田施用有机肥改变了土壤细菌的多态性,并可能达到烟田土壤保育的效果。     

有机肥长期定位施用对烟田土壤养分和烟株根际土壤细菌群落的影响

  目的  解析长期施肥对烟田土壤细菌群落结构和丰度的影响。  方法  通过田间定位试验,研究了长期单一施用化肥（T1）、化肥+稻草回田（T2）和化肥+稻草回田+饼肥（T3）等3个处理对烟田土壤化学性质及烟株根际土壤细菌多样性的影响。  结果  ① 长期采用稻草回田并施用饼肥有利于提高植烟土壤有机质、碱解氮和速效钾含量,降低土壤pH值;②稻草回田或再增加饼肥处理的烟田独有OTU个数均高于单施化肥处理;③在细菌群落组成中变形菌门（Proteobacteria）和该菌门下物种的相对丰度最高,且稻草还田并添加饼肥处理最高;④植烟土壤微生物LEf Se进化分支图表明稻草还田或增施饼肥的烟田在细菌门水平无组间显著差异,而单施化肥的烟田存在组间显著差异的疣微菌门（Elusimicrobia）和迷踪菌门（Verrucomicrobia）。  结论  长期定位施肥条件下,稻草回田并增加饼肥能够改善烟田化学性质综合指标,提高细菌群落结构和相对丰度。      

连作对不同类型植烟土壤化学性状、酶活性及细菌群落的影响

为探明不同类型植烟土壤对连作的响应差异,以云南的红壤、水稻土和紫色土为研究对象,分析烤烟连作5年土壤化学指标、酶活性和细菌群落特征的变化。结果表明,连作5年后,与轮作处理比较,水稻土和红壤的有机质、全氮、全磷、碱解氮、有效磷含量显著增加,pH、速效钾含量显著降低,紫色土仅速效钾含量显著增加,其他指标无明显变化。3种土壤的过氧化氢酶活性显著下降,脲酶活性不同程度增加,但紫色土增加不显著;水稻土的蔗糖酶活性显著下降,红壤和紫色土则变化不明显。3种类型土壤均以变形菌门、蓝细菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和拟杆菌门等5个菌门为优势菌群。连作5年后,不同类型土壤的细菌群落相对丰度与活性存在一定差异,其中紫色土的细菌群落结构组成与轮作处理最为相似,其ACE和Shannon指数在3种土壤中变幅较小。综合比较来看,烤烟连作对紫色土的主要生化指标微生物群落结构影响较小,说明紫色土对烤烟连作响应相对不敏感。     

不同土壤改良措施对植烟土壤理化性状及烟草青枯病的影响

为进一步明确持续多年进行稻草溶田等措施改良土壤后植烟土壤理化性状变化情况,连续9年定点跟踪100%稻草溶田和冬翻晒白对植烟土壤容重、pH、有机质、氮磷钾及烤烟青枯病的影响。结果表明,稻草溶田、冬翻晒白和冬闲均可降低土壤容重,尤以稻草溶田降低土壤容重效果显著;随定点跟踪年限增加,植烟土壤pH总体为下降趋势,而稻草溶田和冬翻晒白可不同程度减缓土壤酸化;与冬闲相比,稻草溶田和冬翻晒白均可增加土壤有机质、全钾和速效钾含量,而随着种烟年限的增加,植烟土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量总体为下降趋势;稻草溶田可显著降低烤烟青枯病发病率和发病程度,冬翻晒白则效果次之。综上所述,稻草溶田和冬翻晒白均可在降低土壤容重、提高土壤pH及增加土壤有机质和钾含量等方面改善土壤理化性状,提高烟株青枯病抗性,尤以稻草溶田效果更好。     

生物有机肥和磷肥配施对新整理黄壤烟田细菌群落组成的影响

适宜的土壤微生物环境是烟草优质适产的必要条件,而烟田整理后土层被大规模搅动,对土壤微生物群落组成产生影响。为明确生物有机肥与磷肥配施对新整理黄壤烟田土壤细菌群落结构和烟叶产质量的影响。以新整理黄壤烟田为对象,连续3年进行了定点田间试验,结果表明,生物有机肥和磷肥配施可以改善新整理黄壤烟田土壤细菌群落结构,烟田土壤细菌群落多样性提高,菌类数增加,绿弯菌门、硝化螺旋菌门、变形菌门及51.4%的菌属相对丰度均高于传统施肥,尤其是生物有机肥和磷肥同时配施效果更佳;烟田土壤细菌群落结构的改善使烤烟的产量、产值与上中等烟比例显著提高。因此,对于新整理黄壤烟田推荐基施生物有机肥675 kg/hm~2配合基施根际营养土1 500 kg/hm~2(1 372.5 kg火土灰、75 kg生物有机肥、15 kg复合肥与37.5 kg磷肥均匀混合)的施肥方式。     

秸秆还田对植烟土壤酶活性及细菌群落多样性的影响

为明确秸秆还田的烟田土壤微生态效应,通过3年定位试验研究了不同用量小麦及玉米秸秆还田对植烟土壤酶活性及细菌群落多样性的影响。结果表明,秸秆还田可不同程度提高土壤蔗糖酶、碱性磷酸酶及脲酶活性。玉米秸秆还田的土壤蔗糖酶和碱性磷酸酶活性高于等量小麦秸秆还田处理。与对照相比,玉米及小麦秸秆中低量(4500及1500 kg/hm~2)还田后土壤的细菌群落多样性下降,而高量(7500 kg/hm~2)还田后则不变或稍有增加。此外,高量玉米秸秆还田与其他处理间的土壤细菌群落相似系数仅为0.57,表明其群落结构变化较大。而且低、中、高量玉米秸秆还田土壤DGGE图谱中的特异条带分别属于乳酸球菌(Lactococcus)、不可培养细菌(Uncultured bacterium)及硝化螺菌(Nitrospira)。可见,两种秸秆还田均能提高植烟土壤的蔗糖酶、碱性磷酸酶和脲酶活性,且玉米秸秆在高量还田后可增加土壤细菌群落的丰度及多样性。     

外源橙皮素对烟草青枯病及根围土壤细菌群落的影响

为明确外源橙皮素对烟草青枯病的防效及对烟株根围土壤细菌群落的影响,基于盆栽试验和扩增子测序技术,连续两年监测了灌施不同浓度橙皮素（1、2和4 mmol/L）后烟草青枯病的发生情况,并分析了烟株根围土壤细菌群落结构。结果表明：（1）单施橙皮素对烟草青枯病的防效为40%左右。（2）灌施1 mmol/L和2 mmol/L橙皮素可以提升烟株根围土壤细菌群落OTU数量和Chao1、ACE等丰富度指数。（3）灌施1 mmol/L和2 mmol/L橙皮素可明显改变根围土壤细菌群落结构,提高土壤中Dongia、鞘脂菌属（Sphingobium）、赭黄嗜盐囊菌属（Haliangium）及拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度,而降低土壤中雷尔氏菌属（Ralstonia）的相对丰度。综合来看,1 mmol/L和2 mmol/L橙皮素是较适宜的灌施浓度。该研究结果为合理利用植物次级代谢产物提供了依据。     

烤烟轮作与连作土壤细菌群落多样性比较

为了解烤烟轮作和连作对土壤细菌群落多样性的影响,分别提取轮作和连作土壤总DNA,用细菌16S rDNA特异引物扩增出细菌16S rDNA,建立克隆文库。用限制性内切酶Hae III和Afa I进行PCR-RFLP分析,分别得到177和147个酶切类型,采用多样性指数对试验结果进行分析统计表明,香农多样性指数和丰富度指数均表现为轮作大于连作。通过构建两克隆文库的系统发育树,并分析主要种群的组成表明:连作文库的优势种群主要集中在酸杆菌门,轮作文库的优势种群主要分布在酸杆菌门、γ-变形菌门、α-变形菌门。说明轮作方式可提高植烟土壤细菌群落的多样性,而连作使植烟土壤细菌群落结构趋于简单,从而导致微生物群落功能失调,可能是引发连作障碍的原因之一。     

不同硫酸钾用量对植烟土壤细菌群落的影响

为研究不同硫酸钾用量对植烟土壤微生物的影响,采用连续8年田间定位试验分析了土壤细菌群落多样性。对各处理植烟土壤16S rRNA V3~V4区进行高通量测序,得到各处理植烟土壤细菌群落的α多样性指数、群落种类组成及丰度信息,并对群落组成及丰度进行了PCA聚类分析及UPGMA聚类分析,将排名前十优势细菌门与土壤pH、土壤酶活性、钾和硫含量进行相关性分析。结果表明：（1）与空闲地相比,不施肥连年栽烟土壤细菌数量降低;而施肥处理中,K₂O的投入量为247.57 kg/hm²,S的投入量为125.46 kg/hm²时,细菌群落丰度、多样性和均匀度明显增加。（2）不同处理的土壤中变形菌门、酸杆菌门和放线菌门均为优势菌群,随着硫酸钾施用量的增多,酸杆菌门相对含量明显减少,而变形菌门与放线菌门均呈不同程度增加趋势。（3）细菌群落相似性分析结果表明,长期施用硫酸钾能显著改变土壤群落组成。（4）相关性分析表明,土壤pH、土壤蔗糖酶、脲酶活性、钾和硫含量对于该地区土壤细菌群落的丰度、多样性及优势种群相对丰度起着重要作用。