黑曲霉SH-2基因组中注释的7个α-葡萄糖苷酶基因的鉴定与表达分析

已公布的黑曲霉CBS513.88基因组中注释了7个α-葡萄糖苷酶基因信息，但其中主要高活性基因一直未报道。本文通过同源重组构建了黑曲霉SH-2菌株7个α-葡萄糖苷酶基因的系列多重敲除株。α-葡萄糖苷酶活性测定结果显示仅agdB敲除株的酶活相较于野生株SH-2降低36%，而其余多重敲除株菌株酶活影响较小。以敲除糖化酶、淀粉酶背景的黑曲霉SH-2-3菌株为宿主，分别敲除和过量表达基因agdB及与已报道的黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因序列相似度最高的基因agdA，结果显示agdB敲除株生长速度在不含葡萄糖的培养条件下最慢，并随着葡萄糖添加量增加；agdB过量表达株酶活提高到野生型的10倍。本研究结果说明目前黑曲霉SH-2基因组中所注释的7个α-葡萄糖苷酶基因中仅agdB为主要高活性α-葡萄糖苷酶基因（占总体酶活36%），黑曲霉SH-2中α-葡萄糖苷酶基因仍需进一步探索。     

柠檬酸发酵过程中黑曲霉α-葡萄糖苷酶和糖化酶变化的研究

以目前柠檬酸生产菌为出发菌株,进行N+注入诱变得到一株柠檬酸高产菌株黑曲霉LD20,将其在500m3发酵罐上进行发酵,分别对发酵过程中α-葡萄糖苷酶、糖化酶、总糖、总酸、还原糖、葡萄糖和pH进行了跟踪测定,结果表明糖化酶GA在20h达到最高酶活895.16U/mL,α-葡萄糖苷酶TGA在24h达到最高酶活322.52U/mL,在整个发酵过程中GA的平均酶活力是TGA的2.9倍,说明在柠檬酸发酵过程中,发酵液的糖化作用主要依赖于GA;在柠檬酸发酵后期TGA比GA对酸有更强的耐受性,主要起到转苷作用,将发酵液中的还原糖转化为非发酵性的糖类,从而生成不能被黑曲霉所利用的残糖。     

柠檬酸工业生产菌黑曲霉TNA09基因敲除体系的构建

黑曲霉TNA09是高产柠檬酸的工业生产菌株,由于经过多次物理和化学诱变筛选,所以对其进行传统遗传改造非常困难。该试验成功构建黑曲霉TNA09原生质体转化方法,实现该工业菌株的基因工程操作。通过试验得出原生质体制备和再生的最佳条件：取CM斜面培养5 d的新鲜孢子约1×108个至100 mL马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth,PDB）液体培养基,于37℃、180 r/min摇床培养17 h,取幼嫩菌丝0.70 g至1.50%裂解酶+0.50%蜗牛酶+0.20%溶菌酶的复合酶体系中,37℃处理3.25 h,该条件下原生质体再生率可达36%,并利用聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）-CaCl2介导的原生质体转化方法一次成功将黑曲霉laeA、cexA基因敲除,为后续的柠檬酸工业菌株的分子改造奠定了坚实基础。     

α-葡萄糖苷酶工程菌发酵条件的研究

工程菌DHS-2携带来自黑曲霉(Aspergillus niger)M-1菌株的高转苷活性α-葡萄糖苷酶基因.对DHS-2的发酵条件进行了优化研究,使其α-葡萄糖苷酶活力由178.53U/mL提高到618.75U/mL,提高了2.5倍.质粒稳定性研究表明,DHS-2在传代100代以内,质粒的保留率为82%以上,表现出较好的稳定性.     

α-葡萄糖苷酶高产菌株诱变选育的研究

α-葡萄糖苷酶是生产异麦芽低聚糖的关键酶.本文以α-葡萄糖苷酶产生菌黑曲霉M-1为出发菌株,经UV、UV-LiCl复合诱变和60Co 诱变选育,成功筛选出了一株遗传稳定性较好的高产菌株C-1,其产酶活力是出发菌株的2.7倍.有望将来应用于异麦芽低聚糖的生产中.     

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。     

突变黑曲霉高产β-葡萄糖苷酶的培养基优化

对实验室筛选出产β- 葡萄糖苷酶的黑曲霉进行辐射诱变处理得到高产酶突变菌株,同时采用单因素和正交实验对黑曲霉产酶培养基进行优化研究.结果表明:经过X射线辐射诱变的黑曲霉产的β- 葡萄糖苷酶活力提高了18.86 U/mL.该菌株最适宜产酶的培养基为(质量分数%): 麸皮与玉米粉(1∶1)1.5、 (NH 4 ) 2 SO 4 0.15、 KH 2 PO 4 0.2、吐温80 0.1,所得酶活力最大可达到59.86 U/mL.     

高产α-葡萄糖苷酶黑曲霉的微波选育及发酵条件优化

采用微波诱变技术对黑曲霉J2进行选育,得到1株α-葡萄糖苷酶活力较高的突变菌株ANY-4,酶活力达到305 U/mL,比出发菌株提高了38.6%,且稳定性良好。通过单因素和正交试验得到最适培养条件为:玉米淀粉80 g/L、玉米浆干粉40 g/L、初始pH 4.5、装液量50 mL/500 mL、接种量3%、培养温度36℃、摇床转速240 r/min、培养时间40 h。在最优培养条件下进行发酵,α-葡萄糖苷酶活力达到427 U/mL,比优化前提高了40%。     

黑曲霉DB056发酵产柚苷酶中试放大研究

对在实验室筛选得到的产柚苷酶菌株黑曲霉DB056进行7、20和200L规模的逐级发酵放大研究.采用高效液相色谱法测定柚苷酶的活力.试验结果表明:随着发酵规模的增大,柚苷酶的两种组分——α-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶的酶活力水平有一定的波动,但酶活力变化基本一致;在200 L规模的发酵中,α-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶的最大酶活力分别为1 069 U/mL和727 U/mL,超过7L和20 L规模发酵过程中柚苷酶的活力水平,从而实现了黑曲霉DB056产柚苷酶200L规模的发酵,显示出该菌株良好的发酵性能和工业应用价值.     

高产高纯度脯氨酰内肽酶黑曲霉工程菌的构建

利用基因工程技术,构建过表达黑曲霉来源带有自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-protAS和过表达以黑曲霉内源高效分泌的葡糖淀粉酶信号肽以及α-淀粉酶信号肽代替自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA。SDS-PAGE结果显示,脯氨酰内肽酶在重组菌株中分泌表达,但是存在不同程度的糖基化。酶活检测结果表明,重组菌株TH2-protAS、TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA的最高酶活分别为1.70、2.19、1.91 U/mL。在重组菌株TH2-SglaA-protA的基础上,利用基因敲除技术,敲除了主要的背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶,结合发酵条件优化,获得了高纯度的脯氨酰内肽酶。综合上述结果可得出结论:可在黑曲霉中同源高效分泌表达脯氨酰内肽酶;glaA信号肽和amyA信号肽明显增加黑曲霉中脯氨酰内肽酶的分泌表达量,且glaA信号肽的效果优于amyA信号肽;将基因敲除和发酵调控相结合,可以有效去除分泌的背景蛋白,获得高产高纯度脯氨酰内肽酶的菌株,该重组菌株具有明确的工业应用潜力。     

黑曲霉发酵牛蒡根的化学成分及对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用

为明确黑曲霉（Aspergillus niger）发酵对牛蒡（Arctium lappa）根的化学成分及其降糖活性的影响,本文采用黑曲霉发酵牛蒡根,分析不同发酵时间不同的发酵品对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用和化学成分的变化。酶抑制实验结果表明,牛蒡根对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用随发酵时间延长而增强,牛蒡根发酵后对二者的抑制率分别提升17.8%和27.9%。采用主成分分析法（PCA）对化学成分分析结果进行统计分析,结果表明不同时间的发酵产品可依据其化学组成分为三个阶段,即第一阶段（1~5 d）、第二阶段（6~14 d）和第三阶段（15~20 d）。通过偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）对三个阶段的差异性成分进行分析,发现绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A是不同发酵时间牛蒡根中的主要差异性成分。在发酵后牛蒡根中的绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A的含量升高,分别可达到发酵前的2.1、148.7和1.2倍。相关性分析结果表明,牛蒡根经黑曲霉发酵后对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用增强与绿原酸、咖啡酸和异绿原酸A含量升高有关。因此,可以通过控制黑曲霉发酵的时间来达到提高牛蒡根中具有降糖作用的物质含量的目的。     

高产柠檬酸黑曲霉菌株的航天诱变选育及其产酸条件的研究

对在工业生产中有较高性价比的产柠檬酸黑曲霉C9为出发菌株,航天诱变后,进行了透明圈初筛、耐酸度复筛、遗传稳定性和产柠檬酸发酵条件实验.结果表明,选育出的黑曲霉AM-51是一株优良的高产柠檬酸菌株.该菌株的耐酸度能达到16％以上,产酸稳定性良好;以玉米粉为原料,在产酸温度为34℃～37℃、初始pH值为5.5～6.5、发酵时间为70h～96h的条件下产酸率基本稳定.当发酵温度为37℃、初始pH值为6.0、发酵时间为84h时,平均产酸率达16.50％,较出发菌株产酸率(12.80％)提高了22.42％.     

激光复合诱变选育木薯原料柠檬酸高产菌

以柠檬酸生产菌黑曲霉 (Aspergillusniger) Wm -0 1为出发菌株 ,通过60 Co γ射线、硫酸二乙脂 (DES)及激光的复合诱变 ,采用高酸、高渗培养基筛选 ,从 2 46株突变株中筛选出一株木薯粉柠檬酸发酵高产菌株Wm 1 0 16,其发酵温度为 (3 9± 1)℃ ,周期 72h ,2 2 %木薯粉摇瓶 (平均总糖 17 9% ) ,产酸平均达 17 2 % ,15 0m3 大罐实验产酸 16 13 5 % ,周期 67h。     

氮离子注入和微波复合诱变选育高产柠檬酸的黑曲霉研究

利用低能离子注入及微波辐射对柠檬酸生产菌进行诱变选育.在30keV能量的氮离子注入以及间隔10s的微波电磁辐射后筛选得到2株产量提高到60％的诱变高产菌,多次传代实验表明菌株遗传稳定性良好,为柠檬酸发酵菌黑曲霉的进一步的育种工作提供了诱变参数和高产出发菌株.     

桑叶中α-葡萄糖苷酶抑制剂产生菌的分离鉴定及诱变选育

从桑叶中筛选出一株糖尿病潜在治疗药物(α-葡萄糖苷酶抑制剂)产生菌,为进一步提高抑制剂量,采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术进行了诱变育种,并初步研究其理化性质及稳定性。在分离得到的188株桑叶内生菌中,以4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside,PNPG)法筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂,筛选到一株细菌Xu W-LB-188,其发酵上清液对α-葡萄糖苷酶抑制率达52.67%。根据菌株形态特性及16S rDNA序列,初步鉴定为萎缩芽孢杆菌。对此菌株进行ARTP诱变,高通量筛选880株突变株,其中突变株T-690抑制活性较出发菌株提高了40.61%,抑制率高达73.25%。实验结果表明,该α-葡萄糖苷酶抑制剂主要存在于发酵液中,是一种极性较大的水溶性胞外产物,且具有良好的热稳定性。     

同步糖化发酵菊芋生产酒精中黑曲霉菌株的选育

使用以菊粉为惟一碳源的培养基从自然界中分离出6株产菊粉酶较强的菌种，其中黑曲霉SL-08还可以最大程度地提高塞尔雏亚酵母Z—06的发酵活力和耐酒精能力，通过紫外和亚硝基胍诱变，得到菌株SL-09，酶活提高近两倍。以菊芋粉为底物，利用黑曲霉SL-09和塞尔雏亚酵母Z-06采用同步糖化与发酵法，30℃发酵60h，使发酵醪酒精体积分数达到19．0％，转化率为理论转化率的86％。     

利用玉米粉产柠檬酸黑曲霉的筛选

以从土壤中分离的黑曲霉为出发菌种,经过紫外线和DES的诱变处理,得到了一株能利用玉米粉为原料的黑曲霉菌株AS35.经过摇瓶发酵柠檬酸的对照试验,结果表明:该菌株能够较好地利用玉米粉,产酸能力达8.6%,原料转化率达66.2%,较原始菌种大大提高.     

高产柠檬酸的SHAM特性黑曲霉突变株的选育

研究了SHAM (水杨酸氧肟酸 )对产酸的影响。 5mg/ 6 0mL的SHAM基本抑制柠檬酸的产生。当W 3菌株在加有 10mg/ 10mLSHAM(L1)的平板上生长时 ,只能着生 10 %的孢子 ,在加有 2 0mg/ 10mLSHAM (L2 )的平板上生长时不能着生孢子。据此选育出不能够在L1平板上着生孢子的SHAM敏感株和在L2平板上能够着生孢子的SHAM抗性株。通过发酵试验 ,SHAMS- 2菌株产柠檬酸比出发菌株W 3高 4 0 % ,转化率达到 91 7%     

高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA?pyrG?asaA）。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃,适合的温度范围是40~80 ℃,在80 ℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。     

黑曲霉产柠檬酸的发酵过程表征及乙醛酸的形成

本文对黑曲霉柠檬酸生产过程的菌体形态、总糖、还原糖及有机酸的变化进行了系统地研究.研究结果表明:整个发酵过程中,菌球形态保持紧密稳定,发酵产物中以柠檬酸为主,产量达到155 g/L.并首次发现柠檬酸发酵过程中伴随有乙醛酸的生成,最大浓度可达9.4 g/L.对于菌种和发酵工艺的改进有着重要的指导意义.