鲢鱼卵高分子质量CPI-I 的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。     

鲢鱼卵中两种高分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料,通过匀浆、酸处理和超滤制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cystine proteinase inhibitors,CPIs）粗提液,进而经Sephacryl S-100分子筛层析、Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析、SP-SepharoseFast Flow阳离子交换层析、ConA Sepharose 4B亲和层析,获得两种纯化的高分子CPIs,即ConA不吸附部分a-1和吸附部分的糖蛋白a-2。二者分别被纯化了102.62 倍和274.28 倍,酶活回收率分别为2.02%和1.42%。通过TSK G2000 SWXL凝胶过滤高效液相色谱结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及其反相酶谱法分析,表明a-2及再次经高效液相色谱法回收的a-1在电泳图上均呈单一带,a-2为单一峰,且a-1的分子质量为139 ku,a-2的分子质量为92 ku。二者均能抑制半胱氨酸蛋白酶（木瓜蛋白酶和鲢鱼组织蛋白酶L）但不抑制丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）。根据a-1和a-2的分子质量及抑制活性特征和糖蛋白特性,推测二者可能为鲢鱼卵Kininogens的不同形式。     

鲢鱼鱼糜蛋白质凝胶特性的研究

研究了鲢鱼鱼糜在不同的加热条件下 ,其凝胶的色泽、强度及显微结构的变化。结果表明 ,鲢鱼鱼糜在 60℃时达到较理想的色泽 (白色 ) ,较佳的凝胶条件为 ,先经过 3 5～ 40℃、60min的凝胶化 ,再经过 85℃、3 0min加热。在 5 0℃加热时 ,出现凝胶劣化现象     

漂洗工艺对鲢鱼鱼糜凝胶强度和色泽的影响

探讨清水漂洗次数、盐水漂洗次数和漂洗温度对鲢鱼鱼糜凝胶强度和白度的影响。结果表明:清水漂洗和盐水漂洗可以显著的提高鲢鱼鱼糜的凝胶强度和白度,采用清水漂洗2次再用盐水漂洗1次的漂洗处理,得到的鲢鱼鱼糜凝胶强度和色泽较好。漂洗温度对鲢鱼鱼糜的凝胶强度和白度无显著影响,但为保持鱼肉的新鲜,漂洗温度不宜过高。     

鲢鱼新鲜度对鱼糜凝胶品质的影响

通过对4 ℃条件下鲢鱼死后10 h感官特性、pH值和僵直指数的变化过程以及鲢鱼死后不同时间鱼肉的挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）值和Ca2＋-ATP酶活性变化的检测,研究鲢鱼肉新鲜度对鱼糜凝胶品质的影响。结果表明：鲢鱼在死后2～3 h开始进入僵直期,鱼体僵直指数升高,pH值下降;随着鲢鱼死后时间的延长,鱼肉的TVB-N值显著升高,Ca2＋-ATP酶活性显著降低。采用死后不同时间的鲢鱼肉制作的鱼糜凝胶,其凝胶强度、保水性和白度均有显著差异,其中以新鲜鲢鱼为原料制作的鱼糜凝胶的凝胶强度最高,而鱼糜凝胶的保水性和白度在鱼肉的僵直期最差。     

鲢鱼CPIs的三种电泳鉴定方法的比较研究

本文对Geltain-substrate-SDS-PAGE反相酶谱法（方法 A）、Native-PAGE反相酶谱法（方法 B）和与papain反应后进行SDS-PAGE法（方法 C）三种电泳方法的鉴定效果、灵敏度进行了对比,确定了鲢鱼卵粗提样中小分子CPIs的最适电泳鉴定方法。结果表明,对于在电泳上活性不稳定的鲢鱼卵小分子CPIs而言,方法 A灵敏度较低,且可能出现假阳性现象;方法 B虽能准确鉴定小分子CPIs的存在,但不能判断分子量。方法 C,即小分子CPIs与papain在37℃下反应5h以上,然后进行SDS-PAGE,抑制剂条带清晰可见,鉴定效果好,且能提供分子量分布信息。此外,尽管荧光底物法和Azocasein法都无法检测到鲢鱼肝胰浓缩粗提液中半胱氨酸蛋白酶抑制活性,但是利用C法,则有效地鉴定了其中CPIs的存在和分子量分布情况。综上所述,方法 C或协同方法 B的电泳鉴定方法,适用于鲢鱼下脚料粗提样品中CPIs的鉴定,效果理想,灵敏度高,操作简便。      

漂洗方式对鲢鱼鱼糜凝胶劣化性能的影响

以新鲜鲢鱼为原料,研究不同漂洗方式下鱼糜凝胶劣化性能,并通过内源性蛋白酶活性的变化来分析其凝胶劣化。结果表明：鱼糜凝胶劣化程度与漂洗方式有关,盐水漂洗可有效地去除鱼糜中的蛋白酶,抑制凝胶劣化,从而形成较理想的凝胶品质;酸洗最不易除去内源性蛋白酶,并且还可能导致部分蛋白质的酸变性,形成的鱼糜凝胶性能最差,不适于鲢鱼鱼糜的加工。鱼糜凝胶劣化与其内源性蛋白酶密切相关,在热处理前若蛋白质已变性会增大凝胶劣化的程度。     

鲢鱼和草鱼下脚料中CPIs抑制活性比较及其分子量分布的鉴定

本研究首先确定偶氮酪蛋白（Azocasein）法和荧光合成肽法测定CPIs抑制活性的适宜反应体系,并证实Azocasein法更适合在鲢、草鱼下脚料（卵、皮）粗提过程中监测CPIs的抑制活性,而在层析过程中需采用高灵敏度的荧光合成肽法。Azocasein法测定表明,草鱼卵（349600units、332units/mg）和皮（25600units、87units/mg）中总活和比活均分别显著高于鲢鱼卵（10620units、3.98units/mg）和皮（3726units、14.14units/mg）;同时,草鱼卵中CPIs抑制总活、比活均高于皮;鲢鱼卵中CPIs抑制总活高于皮,但抑制比活则低于皮;此外,根据Sephacryl S-200分子筛层析中活性峰位置,初步判断两种鱼卵和皮组织中均存在高（50¹28ku）、低（7¹9ku）分子量形式的CPIs,但明胶底物-SDS-PAGE反相酶谱中仅可见高分子CPIs形成的条带,而小于20ku的低分子CPIs均无法得到鉴定。      

聚丙烯酸钠对鲢鱼鱼糜凝胶特性的影响

为改善鲢鱼鱼糜的凝胶特性,研究聚丙烯酸钠对鲢鱼鱼糜凝胶特性的影响。结果表明:0.2%的聚丙烯酸钠可以有效提高鲢鱼鱼糜凝胶的破断力、破断距离、凝胶强度、持水性,降低其蒸煮损失和横向弛豫时间T_2。添加0.2%聚丙烯酸钠的鲢鱼鱼糜先经过40℃水浴加热30 min,再90℃水浴加热20 min形成的鱼糜凝胶比直接在90℃水浴加热50 min形成的鱼糜凝胶具有更高的凝胶强度、持水性和较低的蒸煮损失,同时可以形成具有高度均匀、有序及致密的空间三维网络结构。     

面筋蛋白和大米蛋白对鲢鱼鱼糜凝胶特性的影响

面筋蛋白和大米蛋白均可以明显提高鲢鱼鱼糜的凝胶强度和持水性,降低其蒸煮损失率和横向弛豫时间(T_2)。但是与大米蛋白相比,面筋蛋白在改善鲢鱼鱼糜凝胶特性方面效果更加显著。当面筋蛋白添加量为3%时,鱼糜凝胶的破断力、破断距离、凝胶强度和持水性分别为669.0 g、12.2 mm、8 162.0 g·m和89.8%,与对照组(未添加蛋白)相比分别增加了79.8%、37.2%、147.0%、11.6%;而蒸煮损失率为8.51%,与对照组相比降低了19.7%。且此时的凝胶横向弛豫时间T_(23)和T_(24)分别为42.4 ms和156.0 ms。3%的面筋蛋白促使鲢鱼鱼糜凝胶形成十分致密的空间三维网络结构,使其具有较高的凝胶强度和持水性,但是由于面筋蛋白带有浅黄色,所以鱼糜凝胶的白度有轻微下降。     

鲢鱼与金线鱼混合鱼糜的凝胶特性

为研究鲢鱼与金线鱼混合鱼糜的凝胶特性,本实验对混合鱼糜凝胶的凝胶强度、持水性、蒸煮损失、白度值、横向弛豫时间、微观结构和肌原纤维蛋白进行分析。结果表明：混合鱼糜的白度值较纯金线鱼鱼糜显著提高（P＜0.05）,且鲢鱼鱼糜与金线鱼鱼糜质量比5∶1混合后的凝胶白度值高于纯鲢鱼鱼糜;此配比下的混合鱼糜凝胶性能最好,其中凝胶破断力、凹陷距离、凝胶强度和持水性较鲢鱼鱼糜分别提高了18.33%、27.29%、51.01%和5.65%,较金线鱼鱼糜分别提高了5.84%、19.50%、26.49%和3.45%;该配比下的混合鱼糜凝胶的蒸煮损失较鲢鱼鱼糜和金线鱼鱼糜分别降低了15.88%和7.48%。低场核磁共振分析显示鲢鱼鱼糜与金线鱼鱼糜质量比5∶1混合后的鱼糜凝胶的横向弛豫时间T22比鲢鱼鱼糜凝胶T22缩短了10.34 ms。通过扫描电镜观察发现鲢鱼鱼糜与金线鱼鱼糜质量比5∶1混合时可形成高度均匀、致密的空间凝胶网络结构。肌原纤维蛋白凝胶电泳图显示该配比下肌球蛋白重链（myosin heavy china,MHC）发生交联,大分子聚集体形成,进入凝胶中MHC更少,条带更细窄。     

TGase抑制剂对鲢鱼糜热诱导凝胶形成的影响

本实验通过研究三种转谷胺酰胺酶(Tgase)抑制剂对白鲢鱼糜凝胶的凝胶特性、溶解率、催化肌球蛋白重链(MHC)带强度及微观结构的影响,探讨TGase抑制剂对鲢鱼糜热诱导凝胶形成的影响及其抑制效果。结果表明:鲢鱼糜中存在内源TGase;三种TGase抑制剂均抑制鲢鱼糜凝胶的形成,显著提高鱼糜凝胶的溶解率、增强MHC带强度;随抑制剂浓度的增加,鱼糜凝胶特性显著降低,溶解率显著升高,MHC带强度显著增加;酰基转移反应抑制剂氯化铵的抑制效果最好,其次是巯基阻断剂N-甲基顺丁烯亚胺(NEM),EDTA的抑制效果最小。     

佛手山药粉对白鲢鱼糜制品品质的影响

为提高鱼糜制品的品质,以白鲢冷冻鱼糜为基质,向其中添加佛手山药粉。分析了不同添加量(1%、2%、3%、4%、5%)佛手山药粉对白鲢鱼糜制品的凝胶强度、TPA、持水性、蒸煮损失率、白度值及感官品质的影响。结果显示:当佛手山药粉的添加量为4%时,鱼糜凝胶的凝胶强度、硬度、咀嚼性和持水性均增加到最大值,分别为520.90 g.mm、1553.72 g、1211.20 g和78.18%,与空白组相比分别增加了51.11%、33.39%、24.89%和10.77%,蒸煮损失率达到最小值8.47%,与空白组相比降低了3.21%,感官评价各项指标得分均达到最佳值,不同添加量的佛手山药粉对鱼糜凝胶的白度值无显著性影响(P>0.05)。以上结果表明,佛手山药粉添加量为4%时,可以有效改善白鲢鱼糜制品的品质。