TaqMan探针荧光定量PCR检测花生油中掺入棕榈油的研究

根据棕榈内源基因MT3 -B设计引物和TaqMan探针,采用基因重组技术构建用于检测棕榈基因MT3 -B的重组质粒作为绝对定量标准品,建立标准曲线,对花生油中掺入棕榈油1% ～40%梯度混合油品提取DNA进行棕榈成分定量检测.结果表明,重组质粒标准品荧光定量标准曲线对数线性回归分析相关系数(R2)为0.996;花生油中掺入棕榈油达到5%时,可检出每亳升混合油品中棕榈MT3 -B基因17.431 copies,检测的重复性和特异性好.     

绿色魏斯氏菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

以rpoA基因为靶基因,建立绿色魏斯氏菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测方法。针对rpoA基因设计特异性引物,建立绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测体系,通过特异性、灵敏度和重复性实验评价体系的检测效果,同时与常规PCR方法进行比较。结果表明:实时荧光定量PCR方法能够特异性检出绿色魏斯氏菌,对基因组DNA的检测灵敏度达到2.667×10~(-3) pg/μL,对纯培养物和模拟污染牛肉样品直接检测的灵敏度分别为30 CFU/mL和0.8 CFU/g;与常规PCR相比,实时荧光定量PCR检测的灵敏度是其1 000倍;不同浓度样品独立重复实验循环阈值的标准差均小于1,变异系数在0.02%～1.28%之间。本研究所建立的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能够进行准确的定量检测,是快速检测绿色魏斯氏菌的有效手段。     

牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR快速检测方法,根据沙门氏菌invA基因序列和荧光定量PCR要求设计了合适的特异性引物,然后提取菌体DNA,对目的基因进行克隆,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,以沙门氏菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。结果表明,建立的方法特异性强,与志贺氏菌等致病菌无交叉反应,且方法的灵敏度高(为0.1 ng/L)。以掺入沙门氏菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中44.2 mL~(-1)的沙门氏菌。该方法适用于快速、准确检测牛乳中的沙门氏菌,为实验室快速检测致病菌提供参考。     

定量检测食品中榛果过敏原成分

定量检测食品中过敏原榛果过敏蛋白,构建目的基因的标准品及标准曲线。以榛果的DNA为模板,针对油体蛋白基因设计引物进行PCR扩增,构建质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。成功克隆油体蛋白目的基因片段,并以此为标准制作出荧光定量PCR标准曲线,线性关系良好,灵敏度高,检测限低于10个拷贝,特异性强,准确可靠。成功建立荧光PCR方法定量检测食品中过敏原榛果成分,构建油体蛋白基因的标准品及标准曲线。     

双重实时荧光定量PCR检测转基因植物常用调控元件的适用性研究

目的 建立一种双重实时荧光PCR检测转基因植物中常用调控元件pCaMV35S和tNOS的方法。方法 首先, 通过扩增多个植物DNA来测定此系统的特异性; 然后, 将转基因棉花的模板DNA稀释5个梯度, 检测此方法检出限(Limit of detection, LOD), 建立标准曲线判断该方法的定量能力; 最后, 通过相对模拟掺假试验测定此灵敏度。结果 特异性试验的检测结果显示此系统具备较强的特异性, 能够区分含有上述两种调控元件的转基因植物和非转基因植物。此方法对于pCaMV35S基因的检测限为1 ng, 对于tNOS 基因的检测限为10 ng。依托此方法建立的标准曲线的扩增效率分别为96%和87%, R2均大于0.99, 方法具有定量能力。而且, 方法的相对灵敏度达到1%, 满足混合样品中转基因成分的检测要求。结论 建立的双重实时荧光PCR方法表现出较强的特异性和较高的灵敏度, 有高通量、低成本以及定量检测的能力。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的:建立实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法:针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果:建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

应用荧光聚合酶链式反应检测冷冻羊肉卷中羊肉的含量

目的:探索应用荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测冷冻羊肉卷中羊肉含量。方法:以羊线粒体细胞色素B基因为羊特异性基因,线粒体12S rRNA为内参基因,应用ΔCt法对羊肉含量进行相对定量,并与称重法进行比较,分析基因拷贝数和羊肉脂肪含量对定量结果的影响。结果:荧光PCR法建立的标准曲线在羊肉含量为1%~100%时具有良好的线性关系(R~2=0.990 1)。检测7个市售冷冻羊肉卷样品,荧光PCR方法检测出的羊肉含量与称重法羊肉含量的相关系数为0.945 0(P0.001),平均绝对差异为-11.0%,95%可信区间为(-7.4%,-14.6%)。基因拷贝数不同和羊肉脂肪含量不同对内参基因扩增Ct值影响没有统计学意义(P值分别为0.072和0.206)。结论:荧光PCR法可用于快速检测冷冻羊肉卷中羊肉成分的相对定量。     

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆及其加工产品

本研究运用多重实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因大豆及其深加工制品进行筛选检测。通过设计大豆内源基因植物凝集素(Lectin)和常用的外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止(nos)的特异性引物和探针,反应条件和反应体系的优化,特异性、重复性和灵敏性的实验比对分析等开发建立了多重荧光定量PCR检测技术。以10%Roundup Ready转基因大豆标准品为材料,建立并优化转基因大豆的定量检测体系,对大豆中的转基因成分进行定量分析。结果表明:该方法重复性好,检测特异性强,扩增效率在90%～110%,标准曲线相关系数R2≥0. 98,确定了最低检测限为每20μL反应2. 4个拷贝。结论:由于使用多重实时荧光PCR技术,可实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进农产品和食品进出口提供技术保障。     

TaqMan实时荧光PCR法定量检测生肉中猪源性成分的建立

目的:建立基于Taq Man实时荧光PCR技术的猪源性成分的定量检测方法。方法:选择朊蛋白基因为猪特异性基因和线粒体12S r RNA为内参基因,使用△Ct法进行相对定量。通过对其他种类的肉源DNA进行扩增,以验证方法的特异性;对含有1%猪肉的混合肉DNA进行系列稀释,确定检出限,并对自制模拟掺假肉进行猪源性掺假的测定,对该方法进行验证。结果:所用的引物具有较好的特异性,当模板浓度为50 ng/μL时对猪源性扩增的平均Ct值为22.73,而其他种类的肉源进行扩增时均未能检测到扩增信号,检出限为0.25%(w/w);检测结果在猪肉含量为1%~100%(w/w)范围内具有良好的线性关系,相关系数R2=0.9955。内部验证结果表明,根据标准曲线得到的盲样检测结果同样品真实含量具有较高的一致性,变异系数在0.1270%~1.2044%之间。结论:所建立的Taq Man实时定量PCR法可用于生肉中猪源性成分的定量检测。     

标准分子构建及其在转基因玉米59122定量检测中的应用

根据转基因作物59122的外源基因与玉米基因组之间的左侧侧翼序列设计具品系特异性的荧光探针及引物,以实时荧光PCR技术建立59122的品系特定量检测方法,以重组PCR技术成功获得了标准分子(整合了内标基因序列与左侧翼序列)梯度范围为101～105,定量范围为0.01%～100%;建立了玉米内源基因与侧翼序列的标准曲线,变异系数CV值、标准偏差SD以及相关系数R2均可接受;检测5个已知转基因含量(0.1%、0.5%、1%、2%、5%)的混合样品中的转基因含量,结果分别为0.12%、0.56%、1.04%、1.61%、4.66%,实验误差小于25%,结果可信。