草鱼肝胰中CPIs初步分离鉴定及其活性测定

首先比较了偶氮酪蛋白(Azocasein)法和荧光合成肽底物法,在监测草鱼肝胰半胱氨酸蛋白酶抑制剂CPIs(cysteine proteinase inhibitors)活性时的适用性。进而通过凝胶过滤高效液相色谱法、反相酶谱和免疫印迹法,对草鱼肝胰中CPIs的分子量分布及可能的家族类型进行定性鉴定。结果表明在粗提液中加入丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂(40 mmol/L PMSF或0.4 mmol/L Pefabloc SC),或经90℃加热5 min,仅荧光合成肽底物法可准确地监测到CPIs活性的变化。液相色谱结果显示,草鱼肝胰中存在分子量(98、26、12、5~1 ku)不同的CPIs活性部分。但反相酶谱法仅能够判断其中大于20 ku的CPIs。而免疫印迹法证明存在约12 ku的Cystatin(家族II)类型CPIs,发现小于12 ku的显色条带,可能是该蛋白降解形成的低分子量的活性片段。     

鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究

通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)粗提过程中的比活力(Azocasein法),确定其最佳粗提条件为:以含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)作为匀浆缓冲液,并于30℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22倍。采用Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10倍和1 769.23 U/mg、502.62倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度(48.77%和55.55%),抑制软化。     

鲢鱼卵高分子质量CPI-I的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。     

鲢鱼卵中两种高分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料,通过匀浆、酸处理和超滤制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cystine proteinase inhibitors,CPIs)粗提液,进而经Sephacryl S-100分子筛层析、Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析、SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Con A Sepharose 4B亲和层析,获得两种纯化的高分子CPIs,即Con A不吸附部分a-1和吸附部分的糖蛋白a-2。二者分别被纯化了102.62倍和274.28倍,酶活回收率分别为2.02%和1.42%。通过TSK G2000 SWXL凝胶过滤高效液相色谱结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及其反相酶谱法分析,表明a-2及再次经高效液相色谱法回收的a-1在电泳图上均呈单一带,a-2为单一峰,且a-1的分子质量为139 ku,a-2的分子质量为92 ku。二者均能抑制半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶和鲢鱼组织蛋白酶L)但不抑制丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)。根据a-1和a-2的分子质量及抑制活性特征和糖蛋白特性,推测二者可能为鲢鱼卵Kininogens的不同形式。     

鲢鱼和草鱼下脚料中CPIs抑制活性比较及其分子量分布的鉴定

本研究首先确定偶氮酪蛋白(Azocasein)法和荧光合成肽法测定CPIs抑制活性的适宜反应体系,并证实Azocasein法更适合在鲢、草鱼下脚料(卵、皮)粗提过程中监测CPIs的抑制活性,而在层析过程中需采用高灵敏度的荧光合成肽法。Azocasein法测定表明,草鱼卵(349600units、332units/mg)和皮(25600units、87units/mg)中总活和比活均分别显著高于鲢鱼卵(10620units、3.98units/mg)和皮(3726units、14.14units/mg);同时,草鱼卵中CPIs抑制总活、比活均高于皮;鲢鱼卵中CPIs抑制总活高于皮,但抑制比活则低于皮;此外,根据Sephacryl S-200分子筛层析中活性峰位置,初步判断两种鱼卵和皮组织中均存在高(50~128ku)、低(7~19ku)分子量形式的CPIs,但明胶底物-SDS-PAGE反相酶谱中仅可见高分子CPIs形成的条带,而小于20ku的低分子CPIs均无法得到鉴定。     

干酪乳杆菌胞壁蛋白酶提取条件优化及其水解特性研究

干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个关键的蛋白酶.采用Ca2+-free法研究干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取方法,确定其最佳实验条件.菌体用含有30 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液洗涤3次,然后用含有50.03 mmol/LEDTA-Na2的50 mmol/LTris-HCl(pH6.98)缓冲液悬浮,39.75℃保温,60 min后取出离心(4 500 r/min、20 min、4℃),上清液即粗酶液.用粗酶液与纯化后的酶分别水解各种酪蛋白,粗酶较纯化后的酶能产生更高的ACE抑制能力,而纯化后的酶水解β-酪蛋白产生的抗ACE活性能力最强.     

鲢鱼蛋白制备ACE抑制肽的工艺优化

研究制备鲢鱼蛋白ACE抑制肽工艺条件,利用高效液相色谱法测定不同蛋白酶水解鲢鱼蛋白的ACE抑制率,筛选出风味蛋白酶为最佳酶源。在单因素试验的基础上,采用Box-Beknken中心组合设计建立响应面数学模型。得出鲢鱼蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为初始pH 7.54,酶解温度50.56℃,时间4.5h,加水量46.67mL/10g.鱼肉。经优化后,鲢鱼蛋白ACE抑制肽的抑制率实际值可达81.35%。     

亚麻籽饼粕蛋白提取工艺优化及其水解物抑制α-淀粉酶活性研究

该研究以亚麻籽加工副产物-亚麻籽饼粕为原料制备α-淀粉酶抑制活性肽。采用响应面优化法对亚麻籽蛋白提取工艺进行优化，利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶对所提取亚麻籽蛋白进行酶解，采用3，5-二硝基水杨酸法（3，5-dinitro salicylic acid，DNS）来测定α-淀粉酶活性，比较不同蛋白酶酶解产物的α-淀粉酶抑制活性。根据优化结果与实际条件调整，亚麻籽蛋白的提取条件为pH 9.5，料液比为1∶20（g/mL），温度为50℃，一次浸提时间为120 min以及二次浸提时间为60 min。测得最佳试验条件下亚麻籽饼粕蛋白的提取率为83.27%。α-淀粉酶抑制活性表明，经碱性蛋白酶酶解后得到的酶解产物具有较高的活性，其α-淀粉酶的抑制活性为27%。     

鲢鱼背肌组织蛋白酶L的初步分离及蛋白层析纯化方法

研究鲢鱼背肌中组织蛋白酶L的初步分离和纯化方法,重点研究初步分离过程中酸化处理条件、硫酸铵饱和度和透析袋分子质量对粗酶液中组织蛋白酶L活性的影响,以及纯化过程中不同类型离子交换层析柱和离子交换平衡缓冲液pH值对蛋白层析纯化的影响。结果表明:盐析最佳硫酸铵饱和度范围55%~90%,酸处理最优条件pH 3.0,40 ℃热处理10 min后pH值回调至6.0,透析袋最佳分子质量7 000 u。采用弱阴离子交换和分子筛两步层析法,选取20 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液作为弱阴离子柱的平衡缓冲液,可得到45 ku电泳纯组织蛋白酶L,其纯化倍数为487,回收率为22 mg/1 000 g。本法可最大限度地去除杂蛋白且操作简便、回收率高,为探究鱼糜凝胶劣化现象的有效抑制方法奠定了良好的基础。     

高粱碱溶蛋白ACE抑制肽的制备及其稳定性研究

以高粱为原料,通过碱法提取制备高粱碱溶蛋白,利用不同蛋白酶对其进行酶解,结果表明Alcalase碱性蛋白酶水解高粱蛋白得到的水解产物水解度和血管紧张素转化酶(ACE)抑制率最高。在此基础上进一步考察了碱性蛋白酶酶量、pH值、温度、反应时间这4个因素对水解产物ACE抑制率的影响,并通过响应面实验优化酶解条件,得到Alcalase碱性蛋白酶水解高粱碱溶蛋白制备ACE抑制肽最优工艺为:酶解温度55.5℃,酶解时间1.68 h,pH值7.95,酶量2 360 U/g,此条件下实测ACE抑制率达到75.98%,该ACE抑制肽具有良好的热稳定性和酸碱稳定性,并且在体外经胃肠道酶系消化酶解后,依然能保持良好的抑制活性。