大豆rbcL基因克隆、序列分析及原核表达

利用叶绿体基因组保守性的特征,根据菜豆、豌豆、烟草的rbcL基因序列设计引物,从大豆叶绿体DNA中克隆rbcL基因,全长序列为1488bp,包括1449bp的开放阅读框,编码482个氨基酸。相似性比较显示,此序列与其它10个物种rbcL基因核苷酸的同源性为85．37％～95．31％,氨基酸的同源性为90．87％-96．47％。将该基因与表达载体pET-30a（＋）连接,转化大肠杆菌Rosseta感受态细胞,PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,阳性菌液IPTG诱导后经10％SDS—PAGE分析,结果显示,诱导表达出分子量约为60kD的特异融合蛋白。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

大豆GmNCED 1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84％以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

大豆过氧化物酶基因的克隆及其表达载体的构建

大豆过氧化物酶(soybean peroxidase,sbp)基因的克隆及其表达载体的构建将有利于人们更深入的从分子生物学角度研究sbp 基因的结构与功能。首先从大豆根中获取总RNA,通过RT-PCR 获得sbp 基因。再将sbp 基因与表达载体pPICZα-A 双酶切后连接,构建重组表达载体pPICZα-A-sbp。将pPICZα-A-sbp 转化大肠杆菌筛选阳性克隆体并测序。结果表明：获得的sbp 基因序列与已报道的sbp[U51191(GmEpa1)]基因序列有92% 的同源性。重组表达载体pPICZα-A-sbp 的成功构建为其在毕赤酵母中表达奠定了基础。     

马奶酒样乳杆菌乳糖酶LacZ基因的克隆,原核表达及活性分析

从开菲尔粒(Kefir)中分离出1株马奶酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens ZW3),具有较高的乳糖酶活性,以此菌株为材料,从其基因组中克隆得到LacZ型乳糖酶基因,该基因全长2007 bp,编码669个氨基酸。随后将该基因插入原核表达载体pET-32a中转入大肠杆菌BL21(DE3)进行过量表达,获得了其重组蛋白,纯化后分析了该重组蛋白的乳糖水解活性特点。结果显示,此蛋白在50℃,pH 7.0时乳糖水解活力最高,并在30~55℃,pH 5.0~9.0的范围仍能保持50%以上的酶活力,具有良好的工业应用潜力。     

发菜盐胁迫响应基因蔗糖合成酶S1的克隆及原核表达

利用高通量转录组测序(RNA-Seq)技术对不同盐浓度胁迫下的发菜样本比对分析,从发菜盐胁迫差异表达基因中筛选蔗糖合成酶S1基因,以发菜基因组为模板,克隆蔗糖合成酶S1基因完整片段并进行生物信息学分析,将目的基因导入大肠杆菌初步表达,以此进一步优化目的蛋白表达条件。该研究通过设计特异性引物成功克隆出片段大小为2 409 bp的蔗糖合成酶S1基因。生物信息学分析表明,蔗糖合成酶S1蛋白平均分子质量为92.85 kDa,为亲水性蛋白且保守性高,理论等电点为5.52,不含跨膜区。该蛋白氨基酸序列中含有37个Ser磷酸化位点、13个Thr磷酸化位点、8个Tyr磷酸化位点,其二级结构主要为α螺旋和随机卷曲。纯化回收体外扩增得到的目的基因,连接质粒pETsumo,构建表达载体pETsumo-S1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得预期大小的外源蛋白。优化表达条件可知当菌液OD₆₀₀值达到0.8时添加终浓度为0.05 mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG),37℃、2...     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的克隆及组织表达谱

为揭示牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)小亚基在烟草(Nicotiana tabacum)中的生理功能,采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到1个牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的cDNA序列,命名为NtGGPPS5(GenBank登陆号:KF316932)。该基因全长1320 bp,编码332个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum,XP_004246572)及其野生种(Solanum pennellii,ADZ24721)的GGPPS小亚基的氨基酸序列一致性均为92%,具有一个特征性的异戊二烯合成酶保守的天门冬氨酸富集区。进化分析表明,植物GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS5属于小亚基。实时荧光定量PCR试验表明,NtGGPPS5基因在烟草根、茎、叶和芽中均有表达,表达量为芽叶茎根。     

大豆GmWRKY86基因的克隆及表达

为了研究大豆植物中GmWRKY86基因在植株发育和抵御非生物胁迫中的生物学功能,利用其开放阅读框(opening reading frame,ORF)的PCR产物进行基因克隆,并运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测该基因在不同组织中的表达。序列分析显示:GmWRKY86基因包含3个内含子和4个外显子,其开放阅读框长度为1 572bp,编码523个氨基酸,所编码蛋白质的等电点为8.15,预测分子量为56.82kDa,并且含有2个高度保守的WRKY结构域。进化树分析表明,GmWRKY86蛋白与来自草莓的FvWRKY42和葡萄的VvWRKY2聚为一支。荧光定量RT-PCR分析表明,在检测的所有组织中GmWRKY86都有表达,其中花中表达量最高,种子中表达量最低,说明GmWRKY86基因参与了大豆花器官的发育。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase,ADC）基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5＇非翻译区（5＇Untranslated region,5＇-UTR）、226bp的3＇非翻译区（3＇Untranslated region,3＇-UTR）和2 079bp的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75.1kD的蛋白质。5＇-UTR中含有12bp的uORF（Upstream open readingframe）,编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a（＋）-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21（DE3）,SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E.coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框（包括终止密码子）,编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高（GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159）,并在DE3中高效表达。     

大豆TPS基因家族全基因组鉴定、分类与表达分析

利用大豆基因组数据库,通过生物信息学分析,鉴定并获得大豆TPS家族基因所有成员的全序列、基因结构和定位信息。利用序列比对对大豆TPS家族基因进行进化和分类分析,同时通过soybase大豆发育表达芯片数据库相关信息,对该家族基因成员的组织表达谱进行了检测。研究结果表明,大豆基因组中含有20个TPS家族基因成员。系统发育分析将这些TPS基因分成了两个亚家族。基因定位分析表明,这些成员基因分别分布于大豆的14条染色体上。启动子分析表明,全部大豆TPS家族基因的启动子区都含有逆境反应顺式作用元件。转录水平芯片数据分析同时显示,大豆TPS家族基因大多在花、根、根瘤等组织中存在优势表达。该研究结果将促进大豆TPS家族基因的功能研究与利用。     

花生果种皮特异表达基因AhPSG13的克隆和表达研究

为了克隆在花生果种皮中特异表达的基因,本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出一个277bp的EST序列并进行研究,通过构建花生果皮全长cDNA文库,获得此目的基因G13的全长为1369bp,开放阅读框从第28个碱基始至1122个碱基止,预测分子量为39865.59,等电点5.73。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有4个跨膜结构域和多个活性位点,可能与细胞内DNA转录有关;该蛋白与多种豆科作物的半胱氨酸蛋白酶具有较高同源性,推测为花生半胱氨酸蛋白酶相关基因;RT-PCR研究该基因表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,于30d果皮中表达量最大。本研究克隆的AhPSG13基因序列已经登陆到GenBank,登录号为FJ475061。     

大豆杂交种及其亲本籽粒基因差异表达与杂种优势关系

采用4×5 NC II设计,以大豆鼓粒期未成熟籽粒为材料,应用mRNA差异显示技术,分析杂交种及亲本之间基因差异表达模式,并与杂种优势进行相关分析,以期从基因差异表达角度来揭示大豆杂种优势产生的机理。结果表明,杂交种和亲本之间存在明显的基因差异表达,差异表达模式可分为单亲表达一致一型（110型）、单亲表达一致二型（011型）、双亲共沉默型（101型）、单亲表达沉默一型（100型）、单亲表达沉默二型（001型）和杂种特异表达类型（010型）6种。差异表达模式与杂种表现的相关分析中,有11个相关系数达到显著或极显著水平。差异表达模式与中亲优势的相关分析中,株高与110型,分枝数、单株粒数、单株粒重与001型呈显著正相关。差异表达模式与超亲优势相关分析中,株高、节数与110型呈极显著负相关;茎粗与100型呈显著负相关;株高、虫食粒率和011型呈极显著正相关;蛋白质和110型,株高、节数与101型,百粒重与100型呈显著正相关。说明大豆鼓粒期基因差异表达与杂种优势形成有一定的相关性。     

一种新发生的大豆茎枯病病原菌鉴定

鉴定了一种新发生的大豆茎枯病病原菌。在酸化PDA培养基上所有病原菌分离物菌落呈白色,气生菌丝呈密集的卷毛状,有时部分区域显黄绿色;培养基背面开始无色,随后产生大的、扩展的黑色子座。在接种的大豆茎秆上产生大小不等的黑色子座和分散的分生孢子器。共产生2类分生孢子,其中α型分生孢子丰富,无色,单孢,椭圆至纺锤状形,大小4.05～7.57μm×1.48～3.25μm,含2个油滴;β型分生孢子极少见,无色,线形。在培养基及大豆茎秆上未发现有性态。致病性测定表明选择的分离物引起合丰25大豆100%植株发病和种子腐烂。用AluI、RsaI和HhaI酶切通用引物对ITS4/ITS5扩增的rDNA-ITS产物,所有分离物都产生与大豆拟茎点种腐病菌Phomopsis longicolla一致的酶切谱带;序列比对发现测序的2个分离物ITS序列与GenBank中9个P.longicolla分离物ITS序列100%同源。这是我国首次报道大豆田间发现P.longicolla,而且能引发严重的大豆茎枯病。     

Composition,toxic and antinutritional factors of newly developed cultivars of Brazilian soybean (Glycine max)

Five different recently released Brazilian soybean cultivars (Bays, BR-10, Rio Balsas, Serido and Tropical) were compared for their proximate analyses and presence of antinutritional or toxic factors. As expected, the seeds are rich in proteins, varying from 360·7 to 485·4 g kg⁻¹ flour, and they also have a high amount of fat (from 183·0 to 215·3 g kg⁻¹ flour). Crude extracts from seeds of Bays, BR-10, Serido and Tropical were highly toxic to mice within 1–12 h, depending on the administration route (intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous) and dose used while Rio Balsas was not. These acute effects were very similar to those produced by the soytoxin, a neurotoxin that has been recently purified from the commercial soybean sold in Brazil. The amount of trypsin inhibited in the presence of crude extracts ranged from 28·5 to 62·5 g kg⁻¹ flour. Urease was also present and the seed lectin agglutinated preferentially rabbit erythrocytes. A heat treatment at 92°C for 1 min destroyed completely the toxic activity while the haemagglutinating and trypsin inhibitor activities were abolished within 5 min. At these conditions urease was still active. Due to its high protein content, lack of soytoxin, and low levels of trypsin inhibitor, lectin, and urease it is suggested that Rio Balsas could be an alternative for breeding programmes aimed to improve the nutritional quality of soybeans. ©1997 SCI     

栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代耐盐性、农艺性状与籽粒品质分析

以栽培大豆和滩涂野大豆杂交组合（N23674×BB52）亲本及其经逐代耐盐性筛选获得的4个F4∶5家系为研究对象,对其苗期耐盐性、农艺性状、籽粒品质进行了分析和比较。结果表明：F44个株系的农艺性状都介于两亲本之间。盐胁迫下F5株系幼苗的耐盐系数、干物质积累和相对生长速率高于母本栽培大豆N23674,其中4076株系最为突出。籽粒品质较其父本BB52种群有明显改善,主要表现在籽粒中蛋白质和多数必需氨基酸、含硫氨基酸含量及氨基酸总量高于双亲,粗脂肪含量介于双亲之间,且接近于其母本N23674;4076和4111株系亚油酸含量超过双亲。     

萌发黑豆几种生理生化指标变化研究

研究了黑豆发芽功能成分、酶比活及与其发芽时间的关系。检测结果表明可溶性蛋白在种子中含量最低,在萌发60h时最高达到134.00mg/gDW;可溶性多糖在萌发12h为77.47mg/gDW达到最大值,之后缓慢降低;多酚含量在萌发12、60h时出现两个高峰,在60h达到最高峰1.91mg/gDW。过氧化氢酶比活力在12h含量最高为35.56U/gPr;超氧化物歧化酶比活力在萌发24h时最强为299.33U/gPr,之后随着时间延长比活力有所减弱;过氧化物酶比活力在萌发12h时达到最高67.98U/gPr,之后比活力下降;多酚氧化酶比活力在培养12h时最强比活力为64.09U/gPr,之后比活力有所减弱。结果表明黑豆在萌发过程中随时间发生相应的生理生化变化适应生物生长发育。