北部湾茅尾海副溶血性弧菌的分离鉴定与致病性分析

为解析北部湾海域及水产品中副溶血性弧菌的多样性特征与安全风险,本研究采集了北部湾茅尾海养殖区域海水和水产经济动物样品,利用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)对所采样品进行海洋弧菌的分离和纯化,共分离获得109株疑似弧菌菌株。通过16S rDNA和特异功能基因toxR的PCR扩增并测序鉴定,共检出副溶血性弧菌20株,检出率为18.3%。此外,通过系统发育分析还发现副溶血性弧菌的toxR和tdh基因序列都存在水平基因转移现象,呈现出较大的多样性。对20个副溶血性弧菌菌株的毒力基因tdh进行分析,结果表明有4株携带了tdh毒力基因,检出率为20%,易引起食物中毒,对公共卫生造成的威胁较大。因此,本研究建议采用PCR技术开展副溶血性弧菌特异种属基因和毒力基因检测,准确评估北部湾区域海水及其水产品的卫生安全性,降低爆发水产养殖业病害和食源性疾病的风险。     

PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究

目的：建立用DNA碱基序列检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP )的方法。方法：根据副溶血性弧菌toxR基因设计扩增引物和测序引物,先用PCR特异性地扩增目的片段,再制备单链模版在测序引物引导下用焦磷酸测序法检测DNA碱基序列,检测的序列为CCAA GGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT,则判断为副溶血性弧菌。结果：扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,PCR扩增结果,20株VP均扩增出大小137bp的DNA片段,而创伤弧菌等对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果,20株副溶血性弧菌均测出与预期相符的DNA碱基序列,而其他对照菌株未测出DNA 碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。VP标准菌株ATCC 17802试验菌株发生A-T突变,密码子CCU变成CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子。结论：建立的方法特异性高, 整个试验可在21h-27h完成,是快速检测VP有效手段。     

PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测副溶血性弧菌tlh基因

目的建立检测副溶血性弧菌种特异性tlh基因的斑点杂交方法。方法采用PCR法制备地高辛标记DNA探针,建立斑点杂交条件。杂交反应条件优化如下:杂交温度65℃,杂交时间9～12h,探针使用浓度100～125pg/ml。结果地高辛标记tlh基因探针长度为450bp,标记产量为50μg/ml。探针具有较高的灵敏度和特异性,可重复使用4次。结论本方法具有快速、简便、高效的特点,适用于副溶血性弧菌菌株的鉴定。     

肉骨粉中沙门氏菌及副溶血性弧菌的分离与鉴定

采用传统生化鉴定及血清学方法,联合半自动细菌鉴定仪及噬菌体方法,从FEPAS测试样品肉骨粉中成功分离鉴定出沙门氏菌和副溶血性弧菌,并结合食品微生物学检验实践,对分离鉴定过程进行了总结分析。     

VITEK MS快速鉴定副溶血性弧菌的效果分析

目的评价VITEK MS对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的识别能力。方法培养平板选用弧菌显色平板和血平板,处理方法选用甲酸辅助裂解法(方法1)和直接涂板法(方法2)。每个菌株的不同培养平板与处理方法的组合分别用RUO软件和IVD软件进行鉴定,鉴定结果用配对卡方检验分析培养平板和处理方法对鉴定结果的影响。用RUO软件对图谱做相似性分析。结果 IVD软件可以对139株VP的不同培养平板和方法组合100%鉴定到种的水平,RUO软件对方法1和方法2处理的属水平鉴定率分别不超过60%和45%,种水平的鉴定率分别不超过17%和9%,2种处理方法结果差异具有统计学意义(P0.05)。同一种处理方法2种平板的结果差异无统计学意义(P0.05)。VP图谱之间的相似性为45%～90%,其和溶藻弧菌图谱之间的相似性为54%～78%。结论 IVD软件对VP有较好的鉴定效果,RUO软件对其鉴定效果不理想,甲酸辅助裂解法可以稍微提高鉴定率。VP图谱和溶藻弧菌图谱有交叉聚类的现象。     

MALDI-TOF-MS方法检测、鉴定副溶血性弧菌

目的 应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立快速检测和鉴定副溶血性弧菌的方法。方法 采用副溶血性弧菌标准菌株,在不同的培养基或不同的培养时间进行MALDI-TOF-MS检测,同时对长时间冷冻保存的菌株进行检测,以验证该方法的稳定性和重复性。对不同来源的菌株进行检测,以确认方法的准确性。结果 用PW、TCBS琼脂和弧菌显色培养基等3种培养基,以及分别培养18 h、42 h和72 h的细菌,对该菌的蛋白质谱图影响很小;保存2年的菌株,其MALDI-TOF-MS鉴定分值保持稳定;对来自不同国家和地区的不同来源的菌株都可以得到同样准确的结果。结论 MALDI-TOF-MS方法可以快速、准确地鉴定副溶血性弧菌。因其具有很好的稳定性和重复性,可用于副溶血性弧菌的日常检测。     

水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化

本文用副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因作靶标,优化环介导等温扩增技术检测水产品副溶血性弧菌的方法。体系用Bst DNA聚合酶催化,恒温反应60 min,产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,对各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP和PCR反应,比较二者的敏感度;对32株食源性病原菌（包括分离于水产品的25株副溶血弧菌,1株副溶血性弧菌ATCC17802标准株,大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门氏菌50041各1株）进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP的可靠性。各参数最佳条件为：Mg2+浓度为3.6 mmol/L,dNTPs浓度为0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为4.8 U,内外引物浓度比为8:1,最佳反应温度为63 ℃,时间为60 min;LAMP的检测限为1 CFU/mL,低于PCR方法的最低检测限;特异性试验检测26株副溶血性弧菌均为阳性,6株非副溶血性弧菌为阴性;人工污染试验中检测限达1 CFU/mL,无假阳性。建立的LAMP方法操作简单且灵敏度高,适用于水产食品中副溶血弧菌的现场快速检测。     

上海市水产品中副溶血性弧菌的分离、鉴定及毒力基因和血清型分布

为了了解上海市市售水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemoly ticus,Vp)污染状况和血清型,为防治Vp引起的食源性疾病提供依据。采用GB/T 4789.7-2008国标方法进行分离和生理生化鉴定,根据FDA推荐的引物对种特异性tlh基因和毒力基因(tdh,trh)进行PCR检测。从161份水产品中分离鉴定得到45株副溶血性弧菌,平均检出率为27.95%。通过PCR检测分离株的tdh和trh毒力基因发现,45株副溶血性弧菌均为trh阴性,7株为tdh阳性。45株副溶血性弧菌经血清凝集,结果共分出7个血清群,分别为O1群占2.2%(1/45),O3群占24.4%(11/45)、O4群占15.6%(7/45)、O5群占20.0%(9/45)、O9群占4.4%(2/45)、O10群占8.9%(4/45)、O11群占26.7%(12/45)。     

食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的 建立对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）特异性检测toxR（跨膜转录激活蛋白）基因和tdh（热稳定性直接溶血素）毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法 根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果 结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102 cfu/mL。结论 该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。     

牦蛎食品中副溶性弧菌的分离与鉴定

从出口水产食品牦蛎样品中检测副溶血性弧菌.应用细菌形态学观察、嗜盐性试验、细胞色素氧化酶试验、靛基质试验、赖氨酸脱羧酶试验、精氨酸双水解酶试验、V-P试验、蔗糖分解试验、O/F试验等鉴定疑似副溶血性弧菌菌株.结果表明经相关试验证明,从牦蛎样品分离出的菌株为副溶血性弧菌.结论从水产食品牦蛎中分离出2株副溶血性弧菌.     

LAMP技术快速检测海产品副溶血弧菌的条件优化

本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目标基因设计特异性引物,优化反应条件,并对特异性、灵敏度进行了验证。LAMP最佳反应条件为,外内引物浓度比为1∶8,Mg2+反应浓度为4 mmol/L,d NTPs浓度为3.5 mmol/L,温度为65℃,反应时长为1 h,只对副溶血弧菌产生扩增反应,与其余细菌不产生扩增反应,细菌基因组DNA和纯培养物的灵敏度约为5.45×101 fg/μL和140 cfu/m L,对人工污染食品样品进行检测,检出限为2.8×102 cfu/m L。该方法反应时间短、特异性强、灵敏度高。      

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

ELISA法快速检测水产品中副溶血性弧菌

以副熔血性弧菌抗原免疫新西兰大白兔获得特异性抗体,利用此抗体,进行间接竞争ELISA法实验,确定了抗原抗体最佳反应浓度和一抗稀释度分别为107cfu/mL和1:4000,酶标二抗IgG-HRP最佳工作稀释度为1:1000.以此方法分别对人工染菌水产品及实际水产品进行检测,检测下限为104cfu/mL,检测时间为8h;而经8h增菌后,其检测下限为103cfu/mL.此法与常规方法检测结果完全一致,具有很高的实际应用价值.     

PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法研究

为了满足食品卫生快速反应体系的需要,提高水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的检测效率,本实验针对副溶血性弧菌特异性tl基因设计合成引物,采用酚-氯仿法提取DNA,利用大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)做方法特异性对照,建立了水产品中副溶血弧菌PCR快速检测方法。利用此方法对市场随机抽取的40份水产品进行检测,并用国家标准方法(GB/T4789.7—2003)对该方法的检验结果进行评价。结果表明:该方法操作简便,特异性强,菌液灵敏度为103CFU/ml,含菌量1～10CFU/g的样品经增菌6h后即可检出。与国标方法相比更加准确可靠,检测周期10h即可完成。说明此方法适合水产品中副溶血性弧菌的快速检测。     

新型恒温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

利用DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)设计一对外引物和一对内引物,通过引物特异性识别tlh基因上的六个独立区域来快速检测副溶血弧菌.同时将检测结果与PCR方法进行比较.结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;肉眼观察阳性结果出现白色混浊现象,添加1×SYBR Green Ⅰ荧光染料后,绿色的阳性结果很明显区别于橙色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为IOCFU/ml,PCR方法为103CFu/ml,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法的100倍.因此,LAMP方法用于快速检测副溶血弧菌具有检测过程简单、反应结果肉眼即辨别并且灵敏度高特异性强的特点.实验装置简便,能够提供稳定热源即可,所以LAMP方法特别适合于现场快速诊断.     

副溶血性弧菌vanM基因原核表达及酰基高丝氨酸内酯信号分子鉴定研究

从副溶血性弧菌ATCC33847扩增van M基因,连接到p MD19-T载体进行克隆测序和序列比对;将测序正确的van M序列经Nde I和Eco RI酶切后连接到p ET22b;以IPTG诱导van M基因在BL21(DE3)中表达;利用acyl-HSL报告菌株KYC55检测ATCC33847和带有van M基因的大肠杆菌的acyl-HSL活性;萃取Van M合成的acyl-HSL信号分子,经HPLC-MS测试后与标准品进行对比分析。成功测序了ATCC33847 van M基因,与鳗弧菌van M基因序列相似性达到57%;并构建了p ET22b-van M表达质粒,以0.6 mmol/L IPTG诱导BL21(DE3)表达系统时Van M融合蛋白表达量最大;经过KYC55检测ATCC33847和带有p ET22b-van M的大肠杆菌能够产生acyl-HSL活性;HPLC-MS分析显示,ATCC33847和携带p ET22b-van M的BL21(DE3)萃取物中含有3-Hydroxybutanoyl-HSL(3-OH-C4-HSL)和3-Hydroxydecanoyl-HSL(3-OH-C10-HSL)信号分子。本研究克隆表达了副溶血性弧菌van M,首次证明了副溶血性弧菌利用Van M信号分子合成酶合成acyl-HSL信号分子3-OH-C4-HSL和3-OH-C10-HSL。