甘油发酵生产3-羟基丙酸的代谢改造工程菌研究进展

3-羟基丙酸是一种重要的平台化合物,可以用来合成许多重要的化工中间体及工业化工产品,被美国能源部列为当前最具潜力的12种化工产品之一。文中就近年来以大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)作为宿主进行代谢改造合成3-羟基丙酸的相关研究进行了总结,介绍了当前以甘油为底物发酵合成3-羟基丙酸的主要研究成果,并针对目前存在的问题加以展望,旨在为3-羟基丙酸的工业化生产提供参考。     

不同醛脱氢酶对重组克雷伯氏菌生产3-羟基丙酸的影响

PCR扩增Cupriavidus necator Gab D4和Azospirillum brasilense KGSADH醛脱氢酶基因,分别与经改造获得卡那霉素抗性的p UC19质粒(p UC19Kan)连接,再转化至Klebsiella pneumoniae DSM2026,获得重组菌KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4。经摇瓶发酵,KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4的最高3-羟基丙酸(3-HP)产量分别为3.66与2.56 g/L,与未导入醛脱氢酶的K.pneumoniae对照菌相比,分别提高了352%与216%。对其他产物的研究表明,2株重组菌的1,3-丙二醇(1,3-PDO)的产量低于对照菌,而2,3-丁二醇(2,3-BD)和乙酸产量高于对照菌。该研究首次将C.necator Gab D4醛脱氢酶基因导入K.pneumoniae,并对比了KpKan/KGSADH与KpKan/Gab D4的3-HP产量,实验中确定的性能优良的发酵菌株为继续提高3-HP产量提供了帮助。     

产3-羟基丁酮菌株的筛选及产物分析

从日本传统食品纳豆中分离筛选获得1株产3-羟基丁酮的菌株SF4-3,以葡萄糖为主要碳源,该菌株在37℃,180 r/min摇瓶培养96 h,3-羟基丁酮产量为33.90 g/L,利用气相色谱及气相色谱-质谱联用对菌株SF4-3的发酵液进行分析,结果表明主产物为3-羟基丁酮,纯度为95%以上,不产2,3-丁二酮或2,3-丁二醇。根据形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

具有抑菌作用乳酸菌的筛选及其抑菌物质特性的研究

从内蒙古地区传统谷物发酵食品——酸粥中分离并鉴定的13株乳酸杆菌中筛选具有抑菌活性的菌株,并对其抑菌能力及抑菌物质的特性进行研究。结果表明,菌株NSZL-2(鼠李糖乳杆菌L.rhamnose)和NSZL-12(植物乳杆菌L.plantarum)对指示菌具有较高的抑菌活性,且抑菌能力主要来自菌体的发酵代谢产物。排除酸和过氧化氢的干扰后代谢产物仍具有抑菌活性,且抑菌物质对热具有很高的稳定性。代谢产物经蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、过氧化氢酶、溶菌酶处理后,抑菌能力均有不同程度的降低,说明抑菌物质对蛋白酶敏感,故判定抑菌物质中有蛋白质类细菌素。     

代谢工程改造Escherichia coli生产3-羟基丙酸

以提高3-羟基丙酸的产量为目标,对实验室构建的基因工程大肠杆菌进行改造,敲除形成副产物1,3-丙二醇的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqh D,得到E.coli W3110Δyqh D(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.53 g/L,相比未敲除yqh D基因的菌株,产量提高了5.8倍。另外,敲除了甘油代谢途径中的抑制因子glpR基因,得到E.coli W3110ΔglpR(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.86 g/L,相比未敲除glpR基因的菌株,产量提高了6.7倍。后经5 L罐发酵培养后,3-羟基丙酸的产量提升到15.4 g/L。该实验为进一步利用大肠杆菌工程菌发酵生产3-羟基丙酸提供了研究基础。     

利用地衣芽孢杆菌发酵生产3-羟基-2-丁酮初步研究

初步研究了摇瓶条件下地衣芽孢杆菌发酵生产3-羟基-2-丁酮的工艺条件。分析了摇瓶发酵中菌体生长、产物合成和pH的变化情况;考察了发酵温度、装液量、种龄、接种量等条件对发酵的影响;研究了地衣芽孢杆菌利用不同碳源发酵生产3-羟基-2-丁酮的情况,选取了最适碳源,在此基础上进行了补糖试验;最后采用正交试验方法对培养基进行了优化。在优化的发酵条件下,采用分批补糖的工艺,摇瓶发酵产量可稳定在20 g/L以上,为3-羟基-2-丁酮的工业化生产提供了一定的基础。     

具有抑菌活性植物乳杆菌的筛选及抑菌物质特性的研究

该研究通过牛津杯双层平板法,从分离自四川泡菜的114株植物乳杆菌中筛选对大肠杆菌O157:H7具有较强拮抗活性的菌株,并对其所产抑菌物质的特性进行了初步的研究。结果表明：114株植物乳杆菌的上清液均可抑制大肠杆菌,其中16株菌的上清液经排酸后仍有抑菌作用,并且抑菌作用不受过氧化氢酶影响,经蛋白酶处理后大幅降低甚至消失;在进一步筛选中发现植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质具有耐酸（pH 3）、耐弱碱（pH 8）的特性,在80℃具有一定的稳定性,对不同的表面活性剂、有机溶剂、金属离子、盐浓度、紫外照射时间都具有良好的耐受性;对G^-菌株的抑菌活性强于G⁺菌株,但对供试的乳酸菌没有作用。综上所述,植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质具有蛋白性质,不仅抑菌活性强,而且具有良好的稳定性和广谱抑菌效果,在食品加工和医药行业中具有一定的开发应用潜能。     

植物乳杆菌耐受口腔不良环境及其抑菌特性研究

拟利用前期已经筛选出的可以抑制变异链球菌的植物乳杆菌,研究了能抑制变异链球菌的植物乳杆菌在口腔应用方面的特性的研究。本研究测定了植物乳杆菌对溶菌酶、抗生素、盐和酸的耐受性,测定了五株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,L.plantarum）K25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1的自聚集能力以及分别与变异链球菌的共聚集能力,以及研究了添加植物乳杆菌对变异链球菌自聚集能力和产胞外多糖的影响。结果表明,五株植物乳杆菌对溶菌酶都有一定耐受性,远高于人体口腔唾液的溶菌酶浓度（157μg/m L）。五株植物乳杆菌对酸和盐也有一定的耐受性。L.plantarum YW5-1对抗生素的耐受性较强。添加L.plantarum K25、YW5-1和YW1-1上清液后可以降低变异链球菌合成胞外多糖的能力。5株植物乳杆菌中K25和YW5-1的自聚和共聚能力较强,并且添加了植物乳杆菌后,可以降低变异链球菌的自聚集能力。      

枯草芽孢杆菌拮抗菌的筛选鉴定及其抑菌特性研究

本研究旨在从泡菜中筛选一株对枯草芽孢杆菌具有拮抗作用的产抗菌肽乳酸菌,并对抗菌肽的性质及抑菌效果进行初步研究。以Bacillus subtilis B39为指示菌,通过溶钙圈法初筛、双层琼脂扩散法复筛得到一株具有较强抑制效果的乳酸菌,对其进行形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA基因的系统发育分析。利用硫酸铵沉淀法和有机溶剂萃取法探究抗菌肽的最佳提纯方法,并对该抗菌肽进行紫外全波长扫描定性和一系列抑菌特性的研究。结果表明,从武汉钢花菜市场泡菜样品中筛选到一株对B. subtilis B39具有较强抑制作用的产抗菌肽乳酸菌,通过16S rDNA序列（GenBank 登陆号:MZ751041.1）结合系统发育树分析,鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）并将其命名为L. plantarum WUH3。通过对比发现,采用有机溶剂-乙酸乙酯萃取法可获得抗菌肽的最佳提纯效果,紫外全波长扫描结果显示,该纯化物质具有显著的肽类特征吸收峰。根据L. plantarum WUH3的生长曲线及抑菌活性曲线可知,该菌在生长稳定期时可达最大抗菌肽产量。二倍稀释法测得抗菌肽对B39的MIC为16 μg/mL。通过时间杀菌曲线可知,该抗菌肽对Bacillus subtilis B39具有杀菌作用。该研究在探索可抑制枯草芽胞杆菌的生物拮抗菌方面具有一定的借鉴意义,为L. plantarum WUH3在天然防腐剂领域的开发和应用奠定了基础。     

3-甲硫代丙醛在储存过程中的香气变化的研究

对食用香精中广泛使用的香料3-甲硫代丙醛在经过不同存放期后的香气变化进行了研究.发现该香料在储存过程中会慢慢生成多聚物,从而影响其香气表现.通过气相色谱质谱方法对生成的多聚物进行了定性定量测定,同时对不同时期的产品进行了香气评估.     

辣椒碱的抑菌活性研究

辣椒碱是辣椒中的主要活性物质，在食品和医药方面有重要应用价值。本文以辣椒碱晶体（含量96％）为原料，采用平板空穴扩散法进行辣椒碱的抑菌活性研究。结果证明辣椒碱对供试细菌有较强抑制活性，但对霉菌的抑制作用弱。同时，辣椒碱的抑菌作用受其浓度的影响，浓度在0．0125mg／ml以下无抑菌活性。提爪辣椒碱可作为食品的辣味剂和抗菌剂。     

1株乳酸链球菌素产生菌的筛选鉴定及其抑菌特性的研究

从白菜叶上分离得到21株对乳酸链球菌素(Nisin)有抗性的乳酸菌株,采用杯碟法从中筛选得到抑菌活性较强的菌株T0625,经鉴定该菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)。经测定,发酵液经加热处理,在低pH条件下能够保持较好的抑菌活性,对革兰氏阳性细菌具有明显的抑制作用,但对革兰氏阴性细菌、酵母菌和霉菌不表现抑制作用。研究还证实,T0625的发酵产物的抑菌活性不受胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响。经提取纯化,确定抑菌物质为乳酸链球菌素。     

Antibacterial Activity of Cabbage Juice Against Lactic Acid Bacteria

Fresh juice of Cecile cultivar cabbage (Brassica oleracea) was inhibitory to the growth of four species (including seven strains) of lactic acid bacteria. Inhibition was eliminated when the cabbage was heated (steamed 10 min) before juice extraction. When Lcuconostoc mes-enteroides C33 was tested in juices of three other cultivars of cabbage, growth inhibition was invariably noted in fresh juices, but was variable in heated juices. Fresh cabbage juice (CJ) adjusted to higher initial pH (6.5–7.5) showed greater antibacterial activities than at pH 5.0 to 6.0. When pH 4.0 precipitate from fresh CJ was added to noninhi-bitory CJ (cabbage heated before extraction), antibacterial activity was restored. A heat-labile and pH-dependent factor seemed responsible for activating a precursor into an inhibitory compound.     

芦荟汁的抑菌作用

抑菌试验结果表明,芦荟提取物能有效抑制几种常见球菌和杆菌的生长。长时间的沸水浴处理对芦荟的抑菌活性有一定的影响。高浓度的芦荟提取物与糖、盐协同作用时,对大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌有一定程度的杀菌作用。     

不同植物乳杆菌发酵液抑菌活性及其主要有机酸组成比较

对分离自云南传统发酵食品的18 株植物乳杆菌代谢产物的主要有机酸成分及对病原菌抑菌活性进行分析。采用Spot-on-lawn及琼脂扩散法研究不同植物乳杆菌代谢产物抑菌活性;通过高效液相色谱法分析主要有机酸的种类和产量;选取其中3 株植物乳杆菌对其进行包括生长曲线、pH值、抑菌活性在内的动态监测。结果表明,抑菌活性取决于不同的植物乳杆菌菌株、病原菌及发酵碳源。当大肠杆菌O157:H7作为病原菌、葡萄糖作为碳源时,植物乳杆菌YmL-4-5具有最高的抑菌活性;当沙门氏菌ATCC 6538作为病原菌、果糖作为碳源时,植物乳杆菌S5抑菌作用最强。数据证明植物乳杆菌发酵液的抑菌活性受上清液低pH值的影响,且主要抑菌物质为有机酸。有机酸的主要成分是乳酸（930.9～3 008.7 μg/mL）,其次为苹果酸和乙酸。其中乳酸和乙酸的产量与其对大肠杆菌O157:H7的抑菌活性呈正相关（r分别为0.474、0.488,P＜0.05）。本研究为研发新的生物防腐剂提供了理论依据。     

酸菜中具有抑菌活性乳酸菌的分离鉴定及其产细菌素特性

目前已有研究陆续从不同的乳酸菌中分离到细菌素,但是这些细菌素存在着抑菌谱窄的问题,寻找广谱抗菌性能的新一代细菌素具有重要的理论价值和应用前景。以市售保质期较长的8种不同品牌的酸菜为材料,将青霉菌作为指示菌,通过抑菌实验筛选出一株能产生抑菌物质的菌株L3,经过生理生化鉴定、16S rDNA测序分析确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),故命名为植物乳杆菌L₃,NCBI序列号为MT781360。该菌株在MRS培养基中于37℃培养18～24 h时产细菌素L3的抑菌活性最强。将该培养上清液采用乙酸乙酯萃取,葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50过滤分离纯化,再经Trinice-SDS-PAGE电泳结果显示,细菌素L3的分子质量约为4～5 kDa。细菌素L3对蛋白酶敏感,但其活性不受过氧化氢酶的影响,初步结果显示细菌素L3为蛋白质类物质。细菌素L3在60～100℃处理20 min或121℃处理15 min仍具有较高的抑菌活性,pH值2～10范围内有良好的稳定性;对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及部分真菌具有抑菌活性。植物乳杆菌L_3<...     

1株抑制乳房炎病原菌乳杆菌的筛选、鉴定及其抑菌机理研究

为了研究乳酸菌对牛乳房炎病原菌的抑制作用,降低牛乳房炎所造成的经济损失。本实验以大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、无乳链球菌ATCC14556作为指示菌,综合抑菌试验和黏附试验从8株乳杆菌中筛选抑菌效果较好的菌株。结果表明,乳杆菌KLDS1.0344对指示菌的抑制作用比其他乳杆菌的作用更明显,最大抑菌直径为15.4 mm,经过对16S rDNA鉴定,发现KLDS1.0344为植物乳杆菌,同时,对抑菌机理的初步研究表明,其代谢过程中产生的乳酸和细菌素类物质对抑制三种指示菌发挥主要作用,而且这些抑菌活性物质在酸性条件下才具有更强的抑菌活力。     

一株曲拉源短乳杆菌的分离及其体外抑菌特性分析

摘要：目的 天然牦牛乳曲拉中蕴含着大量的乳酸菌，为丰富食品发酵的有益菌种资源，本试验分离筛选具有抑菌活性的乳酸菌。方法 以西藏牦牛乳曲拉为分离基质，MRS(De Man Rogosa Sharpe)加上1%CaCO3为选择鉴别培养基，运用形态学观察、生理生化试验、16S r RNA基因序列、药敏试验对分离菌株进行菌种鉴定，通过抑菌试验探究其抑菌活性。结果 分离菌株NWMCC0322被鉴定为短乳杆菌，其对青霉素类、四环素类、大环内酯类、酰胺醇类、喹诺酮类、磺胺类、头孢类药物敏感，对多烯类药物中敏。NWMCC0322对指示菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直径达12.0±0.6 mm，其次为甲型副伤寒沙门氏菌11.3±0.3 mm，大肠杆菌11.0±0.5 mm。结论 该短乳杆菌对食品污染常见菌株具有抑菌效果，在食品发酵中有较好的应用价值。     

植物乳杆菌LP21绿色合成纳米硒及对溶藻弧菌的抑菌活性

采用益生菌植物乳杆菌LP21合成纳米硒,为抑制水产养殖中溶藻弧菌感染提供一种新的方法.通过植物乳杆菌LP21绿色合成纳米硒,对所得纳米硒进行透射电镜形貌及能谱分析,粒径仪测定粒径,红外光谱分析纳米硒表面生物分子的分布,并研究纳米硒对溶藻弧菌的抑菌活性.结果 表明,植物乳杆菌LP21还原的纳米硒呈球形,分散性良好;纯化的...     

对羟基苯甲酸酯类化合物抗菌活性的定量构效关系探讨

基于定量结构-活性关系(QSAR)研究对羟基苯甲酸酯类化合物性质具有重要意义。本文采用量子化学密度泛函理论(DFT)和逐步回归分析法研究了具有抗菌活性的11种对羟基苯甲酸酯类化合物的定量构效关系。在B3LYP/6-31G*水平上计算了对羟基苯甲酸酯类化合物的相关量子化学参数,得到在最稳定构型下分子结构参数,通过多元逐步回归分析筛选出对羟基苯甲酸酯类化合物影响抗大肠杆菌活性的主要因素并建立定量构效关系方程,采用留一法分析模型的稳定性及预测能力。结果表明对羟基苯甲酸酯类化合物抗大肠杆菌活性与最低空轨道能量(ELUMO)及偶极距(μ)呈正相关关系,QSAR模型表明化合物的最低空轨道能量、偶极距和极化率是影响对羟基苯甲酸酯类化合物抗菌活性的主要因素,ELUMO和μ越大,抗菌活性越大,所得QSAR模型对该类化合物抗菌活性有较好的预测效果。