XJT-9503高温中性蛋白酶基因Gp1的克隆、表达及序列分析

试验根据地衣芽孢杆菌XJT9503的高温中性蛋白酶酶蛋白所测定的N-端及部分肽段氨基酸序列及质谱分析结果设计了PCR引物,用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503中扩增了高温中性蛋白酶基因Gp1,对所获得的基因进行序列分析测定,并与蛋白酶的氨基酸序列分析对比。GP1基因全序列共1129bp,包括整个阅读框,共编码376个氨基酸。将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-28a中,构建成重组分泌型表达载体pGp1。并在大肠杆菌宿主BL21中得到表达。SDS-PAGE分析显示产物的分子量为27.0×103,同核酸序列测定所推导的值相符。同时,对地衣芽孢杆菌XJT9503中性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析,发现与地衣芽孢杆菌6816丝氨酸蛋白酶和地衣芽孢杆菌1411T角蛋白水解酶基因的同源性为97%。     

铜绿假单胞菌脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

利用PCR方法从分泌脂肪酶的铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增得到了脂肪酶基因,并测定其核苷酸序列,利用基因重组技术构建了脂肪酶基因的分泌表达载体,并在枯草芽孢杆菌中进行了分泌表达。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,表达蛋白占发酵液中蛋白的25%,采用NaOH碱滴定法测定其发酵液酶活为15.26U/mL。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株筛选、鉴定及酶基因克隆和序列分析

目的:筛选和鉴定β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株并对酶基因进行克隆和序列分析。方法:利用透明圈法从食堂锅炉排水口污泥中分离筛选菌株,并采用形态和生理生化特征鉴定菌株。通过PCR方法扩增酶基因,将其克隆于T-载体,用Sanger双脱氧链终止法测定序列。结果:分离筛选的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株呈长杆状、革兰氏染色可变、兼性厌氧、产芽孢(次端生、孢囊膨大)。生理生化试验结果表明:该菌株与浸麻芽孢杆菌(Bacillusmacerans)最为相近,命名为BacillusspA3。PCR扩增获得的酶基因全长734bp,其中开放阅读框架为717bp,编码238个氨基酸。经Blast分析,该序列与多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)和浸麻类芽孢杆菌(B.macer-ans)相似性较高,分别为98%和82%。结论:成功分离了β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株BacillusspA3,酶基因序列与多粘芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌有较高的同源性。     

门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的克隆及其在酵母中的表达

采用同源克隆法获得了门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的全长序列,DNA测序结果表明,该基因的DNA全长序列为801bp,编码267个氨基酸,推测蛋白相对分子量为29.95ku.将该脂肪酶基因连接到pPICZαA载体上得到重组表达质粒,转化Pichia pastoris X-33.脂肪酶基因在Pichia pasttoris X-33中实现了分泌性表达,摇瓶发酵液上清酶活最大可达8U/mL.     

新鲜哈密瓜汁中可培养细菌的分离鉴定及系统发育分析

采用稀释平板法从新鲜哈密瓜汁中分离出48株可培养细菌,通过传统的形态特征鉴定,将其归为10个类群。利用细菌通用引物PCR扩增10个类群代表菌株的16S rRNA基因,并进行序列测定。将获得的序列通过Blast在GenBank数据库中搜索相关菌株的同源性序列,采用Clustal1.81软件比对,用Mega4.1软件构建系统发育树。系统发育分析结合表型特征研究表明,新鲜哈密瓜汁中可培养细菌以芽孢杆菌属为优势微生物类群,主要为枯草芽孢杆菌Bacillus sub-tilis,其次为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、苏云金芽孢杆菌Bacillus mojavensis。此外还有铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepaciastrain、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii,以及肠球菌属Enterococcussp、克雷伯氏菌属Klebsiellasp的菌株。     

Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

Thermomyces lanuginosus脂肪酶(简称TLL)是具有重要商业应用价值的脂肪酶之一。运用RT-PCR技术,从Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因组中克隆得到885 bp脂肪酶基因cDNA序列,其结构基因编码蛋白包含292个氨基酸。将脂肪酶基因cDNA序列开放阅读框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了基因工程菌E.coli BL21/pET28b-TLL。诱导表达后SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子量约为32 ku。筛选获得廉价重组菌培养基,表达条件优化结果表明,当OD600约为0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,在28℃诱导培养7 h,酶活达到41 U/mL。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)β-1,3-1,4葡-聚糖酶基因序列,设计特异性引物,以提取的解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),将此目的基因克隆至pTG19-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠。序列比较发现,此片段与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefacines,M15674)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis,AY365256)分别有99%、95%和94%的同源性。     

酸性普鲁兰酶基因在地衣芽孢杆菌中的表达

根据Genbank公布的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因突变体序列(AX203843)合成普鲁兰酶成熟肽基因。将该基因插入芽孢杆菌分泌型表达载体pHY-WZX,重组质粒转化地衣芽孢杆菌B60608,重组地衣芽孢杆菌实现普鲁兰酶分泌表达。对重组菌产普鲁兰酶的条件进行优化,以含2%药媒和8%甘油的培养基最适合普鲁兰酶表达。     

原桃胶中1株芽孢杆菌的分离鉴定及其主要抗菌物质

从天然原桃胶分离到1株产抑菌活性物质的芽孢杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyr B序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。通过硫铵沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH值、温度和3种蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶)有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽孢杆菌TJ12的主要抗菌物质为杆菌肽A。     

过量表达棉花GDSL脂肪酶提高甘蓝型油菜油脂含量的研究

GDSL脂肪酶作为一种脂质水解酶具有广泛的底物特异性,在植物的油脂代谢、生长发育等众多生理过程中发挥着重要作用。利用RT-PCR技术从发育的陆地棉种子中克隆得到棉花的GDSL脂肪酶基因的cDNA,该基因开放读码框为1 068 bp,编码含有356个氨基酸的蛋白质。对棉花种子发育不同时期进行半定量PCR分析的结果表明,在种子发育15~20 d时,GhGLIP基因的表达量较高。将该基因构建到真核表达载体pCAMBIA2300中,转入农杆菌GV3101后转化甘蓝型油菜野油19,通过筛选和鉴定获得转基因阳性油菜株系。转基因油菜的GDSL脂肪酶活力获得了显著提高,转基因油菜种子的油脂含量比野生型油菜提高了8.68%,提高比率为24.3%。