广东省牛羊肉及其制品中掺杂掺假情况的调查分析

目的对广东省内牛、羊肉及其制品中掺杂掺假情况进行风险监测,从而为监管部门的后续监督管理提供指导性意见。方法使用特异性引物和探针,对广东省市场上出售的牛、羊肉及其制品进行动物源性成分鉴定。并与标签明示肉源进行比对,确认掺假类别。结果共检验50份样品,其中牛肉25份,羊肉8份,混合肉类17份。检出10份掺假肉食品,总掺假率为20.0%。掺假样品均为牛肉制品,羊肉制品为未发现掺假情况。结论用猪肉和鸡肉进行肉类的掺假是目前主要的掺假手段。混合肉类制品在标签明示肉类成分方面比较混乱,部分样品检出标签未标示的肉类成分。进一步开展肉制品的掺假检测具有重要的社会意义。     

实时荧光PCR技术快速检测食品中的牛源成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的食品中牛源性成分快速检测方法.方法:以牛线粒体细胞色素b为目的基因,设计特异性引物和探针,通过特异性、灵敏性实验,及模拟混合肉样和市售肉制品检测,对该体系进行验证.结果:该牛源荧光PCR检测体系具有很好的特异性及灵敏性,可检测1pg牛源DNA的存在,对于各模拟肉类样品中掺杂的牛源性成分,其检测限低至0.5％,且经市售加工食品验证具有较好的应用能力.结论:所建立的牛引物探针体系具有特异性好、灵敏度高,快速高效等优点,可用于对食品中牛源性成分的掺假鉴别检测.     

牛源性成分鉴定的引物和探针

为研发具有自主知识产权的锡林郭勒盟牛源性检测试剂盒。以8种动物的线粒体全基因组序列为基础,通过比对分析筛选出牛特异的引物和探针组合进行荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)。以所设计的引物和探针为基础的牛源性成分检测具有高度的特异性(仅对牛源性样品有典型扩增曲线,对其他动物来源的样品无扩增曲线)。检测灵敏度试验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可以检测到1 pg级的模板DNA。牛肉加工制品中牛源性定量检测试验表明,所研发的引物和探针具有较好的定量检测能力。以上研究结果表明此引物和探针组合适用于牛源性成分的定性和定量检测。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

肉制品中牛源性成分Taqman荧光定量PCR检测法的建立

本实验根据牛线粒体差异序列设计特异性PCR引物和Taqman探针,并基于16S rDNA内参基因设计通用引物及Taqman探针,绘制并通过标准曲线确定样品中总DNA浓度以及牛源性成分DNA浓度,采用相对定量法测定肉制品中牛源性成分的质量分数。并通过特异性、灵敏度实验,及混合肉样回收率及市售肉制品检测,对本方法进行验证。结果表明,方法特异性强,可对牛肉DNA进行特异性扩增。最低检出限为10 pg/μL,具有较高的灵敏度。并根据回收实验可知,平均回收率为98.62%。可以为肉制品中牛肉含量的测定提供技术参考。     

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）,以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明：所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量（mg）与DNA质量浓度（ng/μL）、DNA质量浓度（ng/μL）与基因拷贝数浓度（copies/μL）之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量（x1）与基因拷贝数浓度（ y 2） 之间的关系式为： 鸡：x1=（n*y2）/273.946 - n/886.557 + 0.216; 猪：x1=（n*y2）/64.950 + n/60.644 + 0.215; 牛：x1=（n*y2）/62.839 + n/12.646 + 1.218（n为稀释倍数）;基于建立的ddPCR方法对64 份市售不同种类香肠样品进行检测,在1 份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。     

微滴数字PCR法对肉制品中牛源和猪源成分的定量分析

为准确检测肉及肉制品中肉源成分的含量,实验基于微滴数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerasechain reaction,ddPCR）技术,建立了定量检测肉及肉制品中牛肉和猪肉含量的方法。由ddPCR结果可知,在一定范围内生鲜肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,并以DNA含量为中间值计算出DNA拷贝数（C）与生鲜肉质量之间的换算公式M牛=0.062C－0.943,M猪=0.045C－1.72。应用建立的数字ddPCR方法对已知目标肉种含量的混合肉样进行检测,结果表明测量值和真实值基本一致,且不受外源物种的干扰。通过对市售样品的检测,能够准确检测出不同样品中牛肉和猪肉的含量,并发现存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的ddPCR方法在肉及肉制品中牛肉和猪肉含量的定量检测方面具有较大的应用潜力,可为肉制品真伪鉴别日常检测提供有力的科学依据。     

肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测 方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。     

重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及 牛肉制品中的牛源性成分

目的建立重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及牛肉制品中牛源性成分的方法。方法应用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据牛源性线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列设计筛选了一对可用于扩增的引物,建立基于重组酶介导的等温扩增技术检测方法,并对该方法进行扩增温度、特异性和灵敏性验证。结果 40℃等温扩增条件下,所设计的引物的特异性为100%,该检测方法的灵敏性可达0.1 ng/μL。结论本研究成功建立了牛源性肉制品的等温扩增方法,该方法快速简便,具有较高的特异性和灵敏性,适用于市售生鲜肉制品及加工肉制品中牛源性成分的鉴定。     

应用PCR技术检测掺假肉类

目的建立5种动物源性成分的普通PCR检测方法,4种动物源性成分的实时荧光PCR检测方法,为食品安全服务。方法提取各肉制品的基因组DNA,合成PCR检测引物和荧光探针,优化反应条件和反应体系建立各动物源性成分的检测方法,分析市场上肉类掺假状况。结果建立了几种动物源性成分的检测方法,根据已建方法对保定辖区采集的样品进行检测,羊肉制品56份,掺假率为75%;驴肉制品15份,掺假率为6.7%;牛肉制品5份,掺假率为20%;兔肉制品2份,掺假1份。这些结果表明辖区市场上存在较多的肉类掺假问题,尤其是来自自由市场和烧烤摊的样品,掺假现象严重损坏了消费者的权益。结论建立的PCR检测方法获取DNA快速,检测灵敏度可以达到pg或fg级别,适用于大量肉制品的检测。     

肉制品中羊源性成分的定性和定量检测

通过检测肉制品中DNA的来源进行动物源性检测是打击鲜肉及加工肉制品制假掺假的重要技术手段。依据GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法》合成用于TaqMan 实时荧光聚合酶链式反应的引物和探针,利用鲜肉及加工肉制品进行羊源性成分定性和定量检测方法研究。首先利用12 种不同动物鲜肉组织的DNA检测方法的特异性,然后以羊源DNA梯度稀释液为模板进行灵敏度实验,最后在加工肉制品中检测方法的适用性和定量检测能力。结果表明：此方法具有羊源性成分检测特异性,对其他动物来源的鲜肉DNA均无扩增信号,可以检出羊肉和猪肉混合样品中0.1%的羊肉;方法灵敏度高,可以检出10 pg的羊源DNA;方法适用性广,可以对加工肉制品（羊肉干）进行羊源性成分的定性和定量检测。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素（growth hormone,GH）基因和猪的朊蛋白（prion protein,PRNP）基因2 种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明：该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20 份牛肉制品中,4 份检出猪肉成分,其中3 份的相对含量为29.19%～98.15%,1 份为0.12%（低于本方法检出限5%）。因此,ddPCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。     

基于多元统计分析的牛排掺假定量判别及差异分析

结合市场对食品中不同成分的定量分析的需求，模拟不同比例混合样品，利用高分辨质谱进行数据采集及分析，分别考察主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）统计方法对不同混合比例的样品数据进行分析。相比之下，OPLS-DA模型具有更好的判别效果。通过进行S-Plot分析，分别筛选出25?条猪源多肽及牛源多肽，经线性拟合分析，其中牛源的10?条多肽和猪源的6?条多肽的线性相关系数R2大于0.99，并开展了真实性样品的验证实验，证明筛选的多肽可用于预计样品中的成分含量。这项研究建立了一种量化牛排的方法，并为筛选差异显著性的定量多肽提供新思路。     

基于COI序列的DNA微条形码技术鉴别熟肉制品中11种肉掺假的研究

建立并优化了基于COI序列的DNA微条形码技术（mini-barcoding）检测熟肉制品中11种常见肉类掺假的方法。样品经超声与真空冷冻干燥处理,提取DNA模板和PCR扩增后,目标扩增物经切胶纯化后进行克隆测序,并将测序结果提交GenBank数据库Blast比对。筛选出适合猪、牛、羊、鸡、鸭、鸽子、马、驴、鹅、兔、鼠11种肉类的扩增的通用引物COI-A,对PCR扩增条件进行优化,并建立18个掺假模式,对低经济价值肉类（猪、鸡、鸭、马、驴、鼠）的掺入的最低比例进行考察。结果表明:11种熟肉的DNA经通用引物COI-A扩增后,其扩增效率均为100%,18个掺假模式中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类的最低检出比例为5%,而掺入鸡肉的最低检出比例为10%,而鹅肉、鸽子肉和兔肉的掺假模式中最低检出比例为10%;利用本方法检测30批次市售样品,发现有18批次的熟肉制品存在掺假情况。该方法前处理简单,灵敏度合适,重现性好,可作为高经济价值熟肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。     

膜芯片技术对牛、羊、牦牛、驴肉源食品的掺伪鉴别

采用膜芯片技术,通过对牛、羊、驴、牦牛、鸡、鸭、兔、貂、狐、鼠、猪11 种目标物种的检测,实现对牛、羊、驴、牦牛物种的掺伪鉴别。结果表明：该方法具有良好的特异性和适用性,检测灵敏度和掺伪灵敏度均可达到0.1%,能快速、准确地同时鉴别牛、羊、驴、牦牛、鸡、鸭、兔、貂、狐、鼠、猪11 种动物源性成分,可满足肉类食品样品中对牛、羊、牦牛、驴等掺伪鉴别的检验需求。