共表达N-乙酰转移酶和磷脂酶重组菌的构建及发酵优化

为了提高磷脂酶在毕赤酵母中的表达量,构建了N-乙酰转移酶(Mpr1)和磷脂酶共表达的重组毕赤酵母。Mpr1是一类能催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的胞内酶,能够降低酵母细胞内的ROS水平,具有抗活性氧(ROS)氧化胁迫生理功能。来源于尖孢镰刀菌的磷脂酶(phospholipase)是一类可以将磷脂水解为小分子脂肪酸、甘二酯和磷酸胆碱的胞外酶。研究了Mpr1对重组菌的生长和磷脂酶表达量的影响。为了获得在3.6 L发酵罐中表达磷脂酶的最佳发酵条件,分别从诱导温度、起始诱导菌体浓度和甲醇诱导浓度3个方面研究了重组菌的高密度发酵,以恒溶氧反馈调节补加甘油和甲醇流加仪在线监测流加甲醇。结果表明:当诱导温度、起始诱导菌体质量浓度和甲醇诱导体积分数分别为28℃,40 g/L和1.0%,诱导120 h后磷脂酶活达到最高,为8 100 U/mL,总蛋白含量为8.3 mg/mL,为前期工作中磷脂酶单独表达时的1.33倍。     

毕赤酵母不同甲醇利用表型Mut~+和Mut~s表达FsGLUm基因的比较

将来源于产琥珀酸丝状杆菌的β-葡聚糖酶基因根据毕赤酵母的偏好性进行密码子优化,通过全基因合成该优化基因(Fs GLUm)并构建重组表达载体p PIC9K-Fs GLUm。将p PIC9K-Fs GLUm分别用SalⅠ和BglⅡ酶切线性化后电击转化入毕赤酵母GS115染色体DNA中,经过表型筛选和抗性筛选获得不同甲醇利用表型Mut+和Muts阳性菌株。经刚果红平板检测,在摇瓶水平下,Mut+型菌株表达产物产生的水解透明圈明显大于Muts型菌株表达产物。在发酵罐水平下,Mut+型菌株各时间段表达产物酶活性明显高于Muts型菌株。Mut+型菌株表达的酶活性在甲醇诱导96h达到最大值,为6424U/m L,比活性为2607U/mg,菌体干重为123.6g/L。Muts型菌株表达的酶活性在诱导后108h达到最大值,为119U/m L,比活性为1867U/mg,菌体干重为113.5g/L。以上结果表明,Mut+型毕赤酵母更有利于产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的表达。     

通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享技术

甲醇营养型毕赤酵母是近年来广泛应用的一种外源蛋白表达系统。本课题组在前期研究中构建了一系列能够满足绝大多数毕赤酵母高密度发酵过程工艺控制需求的通用型控制策略:用于细胞培养期的改良型DO-Stat甘油流加策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度受限-溶解氧浓度充足”诱导控制策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度充足-溶氧浓度受限”诱导控制策略。然而,这些控制策略的推广需要极高的时间和人力成本。为此,本文开发了基于Django框架搭建的服务器程序,以实现通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享,并依靠前期开发完成的客户端程序实现控制软件包与不同发酵设备之间的对接。在甲醇利用快型(methanol utilization plusphenotype,Mut+)毕赤酵母表达人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白(HSA-GCSF m)和甲醇利用慢型(methanol utilization slow phenotype,Mut S)毕赤酵母表达人源溶菌酶(hLYZ)实验中分别验证了以上通用型控制策略的网络共享功能。结果表明,Mut+型毕赤酵母诱导60 h后HSA-GCSF m的质量浓度达到532 mg/L;Mut S型毕赤酵母诱导69 h后总酶活达到84032.0 U/mg,对应的比酶活力为52884.0 U/mg;HSA-GCSF m产量和hLYZ活力均达到较优水平。     

响应曲面法优化rmHSA-GCSF的发酵工艺

采用Plackett-Burman设计法对影响巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)的主要参数进行了摇瓶试验,选取到3种显著效应的因素:诱导pH、甲醇添加浓度和诱导时间。再利用响应曲面法(Response surface method)对这3种因素进行进一步研究,得到最佳培养条件:甲醇诱导浓度为2.45%,诱导pH为5.54,诱导时间为66.4 h。采用此优化参数,rm HSA-GCSF表达量的最大预测值达157.5 mg/L。此后,根据优化的培养条件,进行150 L发酵罐放大试验,rm HSA-GCSF表达量达到600 mg/L左右,成功实现rm HSA-GCSF的高效表达。     

玉米谷氨酰胺酶基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定玉米谷氨酰胺转氨酶基因在毕赤酵母中的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPIC9K-TGZ经Sac I线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应扩增验证,甲醇诱导表达。通过正交试验确定工程菌最佳表达条件:表达培养基BMMY,诱导表达时间96 h,初始表达pH值6.0,菌体起始诱导OD600nm值4.0,诱导温度24 ℃,甲醇添加量0.6%(体积分数)、甲醇流加时间间隔12 h/次,诱导48 h后每24 h添加1 g/L甘油。采用优化的条件得到培养基上清的最高酶活达7.51 U/mL。     

重组毕赤酵母生产凝乳酶发酵优化

为了获得毕赤酵母生产凝乳酶的最佳发酵条件,分别从起始诱导OD600、甲醇诱导浓度以及p H等方面研究了P.pastoris GS115在3.6 L发酵罐中表达微小根毛霉来源凝乳酶的高密度发酵,以恒溶氧反馈调节补加甘油和甲醇检测流加控制器在线监测流加甲醇。结果表明,在重组P.pastoris GS115/p PIC9k-chy起始诱导,OD600和甲醇诱导体积分数分别为150和2.0%,诱导p H为5.0时,发酵96 h凝乳酶活达到最大,为1 870 SU/m L,此时对应的生产强度和产物得率均达到最高水平,分别为19.48 SU/(m L·h)和2.42 SU/m L,总蛋白质质量浓度为0.64 mg/m L,凝乳活性与蛋白质水解活性的比值(MCA/PA)为63.43。     

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。     

基于乙醇在线测量的DO-Stat甘油流加策略稳定重组毕赤酵母生产猪α干扰素的性能

重组毕赤酵母发酵生产猪!干扰素(pIFN-!)过程性能不稳定,高密度细胞培养阶段的性能指标直接影响到甲醇诱导期的猪!干扰素表达水平。测定分析甲醇代谢关键酶基因的转录水平以及酶活,发现甘油流加培养末期乙醇的大量(超过6 g/L)和长期积累(超过4h)不可逆转地抑制醇氧化酶(AOX)的启动,是导致猪!干扰素无法正常表达、发酵生产不稳定的主要原因。为此,提出了基于乙醇在线测量的改良型甘油流加控制策略,该策略可以在保证细胞快速生长的同时、将乙醇浓度有效控制在2 g/L以下的水平。与传统DO-Stat甘油流加策略(策略A)相比较,改良型甘油流加策略(策略B)可以强化猪!干扰素的诱导表达性能、确保其发酵生产的稳定:1)相同诱导条件下(甲醇/山梨醇培养基流加体积比1∶1),两个发酵批次大猪!干扰素浓度比使用策略A时优批次的大值分别提高75.5%和29.8%;2)在合理改变诱导条件时(甲醇/山梨醇培养基流加体积比4∶1),大猪!干扰素浓度仍比使用策略A时优批次的大值提高38.9%。     

重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的研究

探讨重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的特性,以期能够通过基因工程和发酵工程技术大规模的生产活性重组藻蓝蛋白。先用甘油作碳源培养重组巴斯德毕赤酵母工程菌,达到一定生物量后,再用甲醇诱导外源重组藻蓝蛋白基因的表达,并测定了甘油浓度、细胞干重、细胞光密度和藻蓝蛋白含量的变化。结果表明:所获得的细胞干重最高达41.93g/L,细胞光密度最高为182.77,藻蓝蛋白的最高产量为61.20mg/L,分泌到胞外的藻蓝蛋白的最高产量为24.32mg/L。该研究为实现藻蓝蛋白的产业化生产奠定了良好的基础。     

非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

毕赤酵母流加培养诱导生产植酸酶的流加控制策略

对毕赤酵母流加培养生产植酸酶过程中的底物和诱导剂流加策略和性能进行了比较研究。在生长期采用基于DO/pH在线测量的人工神经网络状态模式识别控制法(ANNPR-Ctrl)特别有效。它可大幅度提高细胞生产强度,并使以甲醇为诱导剂的植酸酶诱导生产时刻提前。然而,在诱导期ANNPR-Ctrl和pH-Stat法等均不能有效地提高植酸酶酶活。为此,在生长阶段采用ANNPR-Ctrl法,当菌浓达到一个较高水平后,引入一个5~6 h的过渡期,并在此阶段继续利用ANNPR-Ctrl法流加葡萄糖和甲醇的混合物,使细胞对甲醇逐步产生适应。最后,利用纯甲醇和离线检测甲醇的控制方法开始诱导。在此阶段,离线控制可粗略地将甲醇浓度控制在5~15 g/L的范围内,酶活高达320 U/mL,比3种基本控制方式提高了5倍。同时,ANNPR-Ctrl法和离线检测甲醇控制模式的有效组合还缩短了酶活达到最高水平的时间。     

The effect of ethanol and acetate on protein expression in Pichia pastoris

Pichia pastoris is an excellent host for high-level heterologous gene expression, but there is still much interest in improving the productivity of recombinant protein production. P. pastoris produces a small amount of ethanol as a by-product during the glycerol fed-batch phase and the mixed-feed induction phase (glycerol-methanol) of high cell density fermentations, regardless of the phenotype (Mut+, Mut(s), or Mut-). We have nvestigated ethanol repression of the AOX1 promoter using strains, GS115 (Mut+) and MC100-3 (Mut-), expressing an AOX1-lacZ fusion. The addition of 10 mg l(-1) ethanol at the start of methanol induction delayed beta-galactosidase production and methanol utilization for four hours in shake flask experiments. When ethanol and acetate were added together, all of the ethanol was converted to acetate, which also represses the AOX1 promoter. The effects of ethanol and acetate on protein expression in P. pastoris at shake flask and fermentor conditions are discussed.     

Effects of methanol feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris

The effects of two types of methanol feeding methods in a continuous culture of Pichia system on the cell growth and recombinant protein expression were studied using chimeric alpha-amylase as a model protein. With the feeding of methanol by a DO-stat method, the alpha-amylase concentration in the fermentation broth increased with decreasing dilution rate and reached 173 mg/l at a dilution rate of 0.013 h(-1), at which the maximum volumetric productivity of alpha-amylase was obtained. Although almost the same productivity was attained at 0.04 h(-1) with continuous methanol feeding, the alpha-amylase concentration was one third that compared with feeding by the DO-stat method, that is, 55 mg/l. Furthermore, at this dilution rate, the medium volume needed per unit time was three times that required when DO-stat was used. Therefore, continuous culture with methanol feeding by the DO-stat method may be a promising method for the production of recombinant proteins on an industrial scale by Pichia pastoris.     

Production of single-chain variable fragment antibody (scFv) in fed-batch and continuous culture of Pichia pastoris by two different methanol feeding methods

This study examined the effects of two methods of methanol feeding, DO-stat and methanol concentration control, in fed-batch and continuous cultures of Pichia pastoris on cell growth and single-chain variable fragment antibody (scFv) expression. By maintaining the methanol concentration at 3.9 g l(-1) in fed-batch culture, a scFv concentration of 198 mg l(-1) was obtained. In continuous culture using both methanol feeding methods, the scFv concentration in the fermentation broth increased with a decreasing dilution rate. A maximum scFv concentration of 810 mg l(-1) at a dilution rate of 0.0094 h(-1) was obtained by maintaining the methanol concentration at 3.9 g l(-1). Although the specific methanol consumption rate was the same for both methods, the specific productivity of scFv was higher in methanol concentration control from 0.0094 to 0.049 h(-1) than it was in DO-stat control. Therefore, continuous culture with methanol feeding by the concentration control method shows promise for the industrial scale production of recombinant proteins by Pichia pastoris.     

重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性

分析了重组甲醇营养型毕赤酵母在5L多参数自控发酵罐上生产人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白(HSA-IL-2)的发酵过程。在使用多种在线传感器和离线检测参数的基础上,应用相关性分析的方法将细胞生长的关键酶(乙醇氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶)酶活和代谢特性相关联。实验结果显示,甲醇诱导后葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶活分别下降了46.1%和66.8%,说明胞内代谢流发生了迁移:三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(HMP)中代谢流通量下降,甲醇完全氧化代谢成为主要代谢流。此外,在不同控制策略下,乙醇氧化酶的酶活和重组蛋白HSA-IL-2表达量也呈现出一定的差异。高溶氧低甲醇控制方式下HSA-IL2的表达量达到27mg/L,比低溶氧高甲醇条件下的表达量高33.7%。     

草果甲醇溶出物抑制α-葡萄糖苷酶活性及调节血糖作用

目的:研究草果甲醇溶出物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及对小鼠高血糖的调节作用。方法:采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷法（PNPG）,以阿卡波糖为阳性对照,进行α-葡萄糖苷酶体外抑制试验,评估草果甲醇溶出物的α-葡萄糖苷酶抑制率。用高脂饲料喂养小鼠构建异常血糖小鼠模型,在高脂饲料基础上,分别添加100、200 mg/kg的草果甲醇溶出物干预6周,评估草果甲醇溶出物对小鼠空腹血糖、葡萄糖耐量以及胰岛素抵抗的影响。结果:当草果甲醇溶出物溶液浓度为500 mg/L时,对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到63.72%。草果甲醇溶出物对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度（IC₅₀）为0.145 mg/mL。在经灌胃低、高剂量组的草果甲醇溶出物干预2周后,小鼠空腹血糖开始降低并维持稳定,草果低、高剂量组葡萄糖耐量曲线下面积（AUC）在干预6周后均低于模型组（P<0.05）。结论:草果甲醇溶出物可明显抑制α-葡萄糖苷酶活性,并能明显改善小鼠葡萄糖耐量水平。     

基于自联想神经网络的毕赤酵母发酵过程两阶段故障诊断

在毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素-2融合蛋白(IL-2-HSA)过程中,诱导期甲醇浓度和pH值直接影响了IL-2-HSA表达量的高低和发酵过程的稳定。为了准确有效的控制这两个参数,本论文基于毕赤酵母诱导期的生理学特性和过程参数特征,提出了基于自联想神经网络的毕赤酵母表达IL-2-HSA过程的诱导期两阶段故障诊断。研究结果表明该诊断系统能够在线快速准确地诊断出毕赤酵母诱导期的各种故障。当系统提示出现故障时,离线分析,对比最优的pH值和甲醇质量浓度变化曲线,确定故障类型,采取相应措施。     

重组毕赤酵母产凝乳酶发酵条件研究

以重组毕赤酵母GS115/pPICZaA-Prochy为凝乳酶生产菌种,研究其在5L发酵罐水平的最佳产酶条件,为中试生产提供依据.采用批量发酵,甲醇浓度0.1％,诱导阶段每12h添加10g/L蛋白胨,发酵液pH值为3.0,油酸浓度0.2％,诱导初期批量加入10g/L山梨醇共基培养,诱导84h可获得152SU/mL的酶活力.采用十二烷基磺酸钠-苯琼脂糖凝胶电泳分析,在发酵液(去菌体后)样品盐离子浓度2mol/L,流速2.5mL/min,酶回收率达到82％,浓缩倍数20倍.     

利用甲醇厂CO_2尾气培养小球藻

利用甲醇厂所排放的高浓度CO2尾气培养小球藻,研究不同的通气方式、培养方式对小球藻生长的影响。实验结果表明,当通气速率为300 mL/min、CO2浓度为10%并以10 min/h的间歇通气方式培养时能够提高小球藻的生物量,生物量和产率分别为0.681 g/L和0.082 g/(L.d)。对氮源和磷源采用补料的方式进行培养时对小球藻生长具有促进作用,最高生物量和产率分别达到0.789 g/L和0.088 g/(L.d)。当培养基的更新率为20%时能够获得较高的生物量。利用醋酸进行兼性培养时,一次性添加50～125μL/L醋酸都可促进小球藻生长,每日添加10～25μL/L的醋酸时,可明显促进小球藻生长,最高生物量和产率分别为0.933 g/L和0.111 g/(L.d),分别是空气对照的1.3倍和1.4倍。说明利用甲醇厂高浓度CO2尾气培养小球藻提高生物量是可行的。