玉米变性淀粉两种不同DNA提取方法的比较研究

采用两种不同方法对玉米变性淀粉基因组DNA提取比较,并经特异性引物进行实时荧光定量-聚合酶联反应(qRT-PCR)检测,从中选择出更适合玉米变性淀粉后续转基因成分检测的DNA提取方法。通过采用磁珠法和试剂盒法提取玉米变性淀粉基因组DNA,比较不同方法的提取效果。结果表明,试剂盒法的提取效果优于磁珠法。实时荧光定量PCR结果显示,试剂盒法提取的基因组DNA均可扩增出标准的S形曲线,而磁珠法提取的基因组DNA则无任何扩增信号。该研究为检测玉米变性淀粉中的转基因成分奠定了基础。     

磁珠法提取植物蛋白饮料DNA

目的 建立一种快速、高效的植物蛋白饮料基因组DNA提取方法并应用于植物蛋白饮料中植物源性成分的检测。方法 以豆浆、豆奶、芝麻糊、花生牛奶、榛子乳5种植物蛋白饮料为研究对象, 建立利用硅羟基磁珠提取植物蛋白饮料DNA的方法, 通过分析所提取DNA的浓度和纯度, 实时荧光PCR扩增效率, 并与十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)比较, 综合评价磁珠法提取植物蛋白饮料的效果。结果 大部分样品磁珠法提取的DNA浓度比CTAB法高, ODA260/A280均大于1.70。 结论 磁珠法提取的DNA纯度较高, 杂质少, 能满足植物蛋白饮料源性成分的分析要求, 尤其适用于大豆类蛋白饮料的DNA提取, 为快速、高效获取质量好的植物蛋白饮料基因组DNA提供参考。     

进口玉米酒糟粕中转基因品系检测方法的比较研究

以美国进口玉米酒糟粕(DDGS)中转基因玉米品系MIR162的实时荧光PCR检测方法为研究内容,分别采用3种常见商业化试剂盒提取基因组DNA,采用3个检测标准中规定的实时荧光PCR方法进行MIR162定性检测,比较了9种方法组合在检测玉米酒糟粕中转基因成分的检测技术性能。结果表明,使用TIANGEN?植物基因组DNA提取试剂盒和《SN/T 1196—2012转基因成分检测玉米检测方法》规定的荧光PCR方法,检测灵敏度最高,符合现行检验监管法规要求。考虑到大宗农产品及其加工产品的国际贸易普遍存在转基因成分低水平混杂的情况,进一步探讨了进口农产品转基因成分检验监管分类管理的必要性,提出针对不同风险级别的进口农产品采用灵敏度相适宜的检测方法。     

实时荧光定量PCR技术在食用油脂检测中的应用

荧光定量PCR检测技术具有快速、准确的优点,在转基因食品检测等领域得到了广泛的应用。采用荧光定量PCR技术进行油脂转基因、掺假检测也成为研究热点。利用不同油料作物所含有的独特核酸序列,采用荧光定量PCR技术可简单、高效、快速地检测出油脂中所含的特定核酸成分,从而判定油脂原料的构成,为打击食用油脂掺假造假提供判定依据。植物油的加工过程中都经过多个步骤的处理,其中的核酸降解严重,含量极低,所以从植物油中提取出较高质量的DNA是对油脂进行荧光定量PCR检测鉴定的关键。本文主要对油脂DNA提取方法及存在的难点、引物设计特点和结果分析进行了论述,以期为今后荧光定量PCR检测技术进一步推广与应用提供思路。     

烘焙食品中转基因成分定性检测的FAPAS能力验证结果与分析

目的分析参加FAPAS烘焙食品中转基因成分定性检测能力验证的结果。方法根据FAPAS组织方提供的能力验证作业指导书、国家标准GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法(部分步骤改进)和行业标准SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》对一份烘焙食品测试样品进行转基因成分定性检测。结果该样品检出pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2和MON863品系(基因),未检出Bt11、Bt176、GA21、MIR604、MON810、MON88017、MON89034、MON89788、NK603和TC1507品系。结论本实验重点对核酸提取方法进行改进并严格质控,满足了烘焙食品这类加工样品转基因定性检测要求,获得能力验证结果为满意。     

不同核酸提取方法用于多重荧光PCR法检测3种混合熟肉的比较分析

目的 探讨不同核酸提取方法以及蒸、煮、烤烹饪方式制作的混合熟肉制品的多重荧光定量PCR检测结果之间的差异。方法 用3种不同的提取方法：抽提法、离心柱法及磁珠法,提取经过蒸、煮、烤烹饪方式制作的牛、鸡、猪、鸭混合样品的DNA,通过对不同方法提取DNA的质量及提取DNA用于多重荧光PCR检测的效果方面进行比较。结果 三种方法提取DNA的浓度及纯度无明显差别,磁珠法提取的混合样品DNA进行多重实时荧光PCR检测的Ct值最小,扩增效果最佳。结论 该研究中磁珠法提取熟肉制品DNA的检测效果更为理想。     

大豆卵磷脂DNA的提取方法及应用

以大豆卵磷脂为研究对象,比较了CTAB法、磁珠试剂盒法以及硅胶膜试剂盒法等3种DNA提取纯化方法。通过大豆内源基因Lectin实时荧光PCR检测,发现CTAB法提取的大豆卵磷脂DNA质量优于其它两种方法,并以CTAB法为基础进行条件优化,进一步提高DNA纯度。采用该方法对6个不同品牌的市售大豆卵磷脂产品进行转基因成分(CAMV35S启动子及NOS终止子)检测,结果证实均不含转基因成分。     

转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性实时荧光(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测方法。方法利用Taq Man实时荧光PCR(real-time PCR)技术,根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段P-e FMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为15 pg,相当于9拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA,重复性试验显示,其标准偏差(Standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均在可接受范围内。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。     

大豆粉转基因成分能力验证样品的检测分析

目的 提高实验室对转基因大豆定性检测的准确性和检测人员专业技术水平, 增强实验室竞争力。方法 通过核酸蛋白仪器分析法和单重实时荧光PCR (simplex real-time fluorescence PCR)法对样品内源基因扩增的循环阈值的影响来比较2种方法, 分析2种DNA提取试剂盒的提取质量。对标准SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》扩增反应体系中DNA模板量进行优化后, 对样品进行检测。再依据标准SN/T 1202-2010《食品中转基因植物成分定性PCR检测方法》的要求, 对样品进行检测。最后对2个标准的检测结果进行比对。结果 通过内源基因扩增循环阈值的数据确认, 更能准确反映试剂盒提取的DNA是否满足后续外源基因的分析检测要求。2种标准方法对19-N578和19-M913 2个待测样品的检测显示3种外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS均为阴性, 19-N578和19-M913待测样品均为非转基因大豆。结论 本次能力验证获得满意评价。DNA提取质量的评估, 体系中DNA模板量的优化, 检测方法的选择和实验的质量控制都是影响能力验证结果的重要因素。     

免疫磁珠结合PCR-试纸条法鉴定金枪鱼成分的研究

目的 建立一种快速检测金枪鱼成分的免疫磁珠结合PCR-免疫金标试纸条方法。方法 本研究使用免疫磁珠法提取金枪鱼样品的核酸,针对金枪鱼基因组特异性基因片段设计引物,优化反应体系和反应条件,建立金枪鱼成分PCR产物试纸条检测方法,验证方法的特异性、灵敏度和稳定性,并对市售金枪鱼产品进行检测。结果 免疫磁珠法提取市售金枪鱼样品DNA的纯度高。所建立的PCR-试纸条方法特异性强,仅金枪鱼能扩增出229bp特异性DNA片段,试纸条检测线变红,其他鱼类均无非特异性扩增条带,试纸条检测线未变红色;灵敏度高,达到0.01%;方法快速,PCR产物的试纸条判读时间5分钟。结论 该方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简便环保等优点,适用于金枪鱼成分的快速检测。     

Combinatory SYBR® Green Real-Time PCR Screening Approach for Tracing Materials Derived from Genetically Modified Rice

Two real-time PCR approaches for the detection of genetically modified (GM) rice were tested: (1) a combination of SYBR® Green real-time PCR methods detecting the 35S promoter (P-35S) of Cauliflower Mosaic Virus, the nopaline synthase terminator (T-nos) of Agrobacterium tumefaciens and the Bacillus thuringiensis (Bt) CryIAb/Ac toxins and (2) a P-35S/T-nos duplex TaqMan® real-time PCR system. Both systems correctly recognized their respective targets in control samples of Bt63, Kefeng6 and KMD1 insect-resistant and LLRice62 and LLRice601 herbicide-resistant rice. Due to its lesser specificity but broader genetically modified organism (GMO) coverage capacity, the SYBR® Green real-time PCR approach was further tested in more detail. Melting curve, capillary and agarose gel electrophoresis analyses indicated that the P-35S, T-nos and CryIAb/Ac targets in the GM rice events are similar to the corresponding targets present in many known GMOs. High-resolution melting analysis showed that the CryIAb/Ac targets of the GM rice events Bt63 and Kefeng6 matched best the corresponding Bt11 CryIAb sequence. Digital PCR analysis on genomic DNA from the GM rice Bt63 and Kefeng6 events indicated that both GMO contained multiple inserts. Sensitivity tests showed that all SYBR® Green real-time PCR methods could detect their targets at less than an estimated five copies per reaction. Finally, it was shown that these SYBR® Green real-time PCR methods could detect low levels of their targets in rice consignments originating from China. Together, these results demonstrated that a ‘P-35S and T-nos and CryIAb/Ac’ combinatory SYBR® Green real-time PCR screening is highly suited to trace the respective targets including the possible presence of Bt63, Kefeng6 and KMD1 GM rice materials in food products.     

Systematic comparisons of genetically modified organism DNA separation and purification by various functional magnetic nanoparticles

DNA extraction is always an important and key step in bioanalytical fields for target nucleic acid detection. Traditional organic solvent‐based extraction methods are toxic and time‐consuming. In this work, we report a systematic study of magnetic nanoparticles (MNPs) as probes for genomic DNA extraction from genetically modified organism (GMO) plants. Different surface‐functionalised MNPs with controllable diameters have been used to extract the genomic DNA directly from GMO plants for detections. Systematic comparison of the results obtained under different extraction conditions has indicated that carboxyl‐modified MNPs with smaller diameters are more suitable for genomic DNA extractions. The successful qualitative detection of GMO and non‐GMO products based on the MNP extracted DNA is also achieved and discussed in this article. In view of the advantages of magnetic extraction, such as nontoxicity, ease of operation, and rapid and high throughput, this systematic research has demonstrated the great potential of the method and provides theoretical guidance for practical MNP applications.     

植物源食品DNA制备方法的比较研究

目的：探索可用作PCR方法检测和鉴定植物源转基因食品模板的DNA抽提方法。方法：分别用改良CTAB法、SDS法制备黄豆、玉米、土豆和番茄及其加工产品的DNA，PCR扩增叶绿体基因片段及黄豆、玉米的内参照基因lectin和zein10。结果：改良CTAB法所得DNA作为PCR扩增模板，叶绿体基因片段及lectin和zein10均呈阳性，SDS法所得DNA作为模板时，部分样品内参照基因lectin或zein10扩增阴性。结论：PCR方法检测转基因食品时，应用改良CTAB法制备DNA模板。     

基于磁性纳米粒子的粮油制品真伪鉴别技术研究

通过PCR检测食用油中内源性DNA是鉴定食用植物油品种真实属性,检测食用油掺假的一种有效方法。然而由于精炼的食用油中DNA含量极低,如何有效富集食用油中的DNA是实现PCR鉴别粮油的关键。因此,作者研究了磁珠法富集食用油中的DNA并通过实时荧光PCR检测芝麻油、菜籽油、稻米油的内源基因。结果表明经过5次乳化后和磁珠进一步富集水相中的DNA,实时荧光PCR成功检测到了食用油中的内源性基因,琼脂糖凝胶电泳分析进一步证明实现了上述3种食用植物油的定性鉴定。     

转Bt基因水稻种子中Bt蛋白含量测定方法的研究

采用ELISA技术检测转Bt基因水稻中Bt蛋白的含量,判断水稻样品中是否含有转基因成分。利用研磨、酶标、孵育等技术对样品进行前处理。采用阳性质控物浓度等倍稀释方法,建立标准曲线,相关系数为0.997 4。用一系列不同转基因含量的标准基体材料,分析方法的最低检测限,灵敏度达0.1%。通过对我国进入生产性试验的转Bt基因水稻品系TT51-1和科丰6号的测试,表明该方法与普通PCR方法真实性和灵敏度一致,可以广泛应用于转Bt基因水稻及其粗加工产品的转基因成分检测。为转基因生物安全监管和安全性评价提供技术支撑。