EDC法制备黄曲霉毒素B1人工抗原的研究

本研究采用EDC法制备了黄曲霉毒素B1人工抗原，通过TLC与ELISA对制备过程监控，确定了最佳的肟化反应时间与偶联反应时间。同时，就黄曲霉毒B1与牛血清白蛋白的起始摩尔比对偶联产物中这两物质摩尔比的影响进行了研究。结果显示，在25℃肟化反应24h、偶联反应24h，当黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的起始摩尔比为30：1时，得到了黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的摩尔比为5：1的黄曲霉毒素B1人工抗原。     

双酚A完全抗原的制备

采用重氮化法在双酚A(BPA)上引入羧基,将其与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备双酚A完全抗原BPAH-BSA.紫外扫描光谱和红外光谱实验表明偶联成功,为进一步制备抗BPA抗体提供了良好的免疫原.     

黄曲霉毒素G1人工抗原的合成

以间氯过氧苯甲酸(m-chloroperbenzoie acid,MCPBA)为氧化剂,使黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)转化为其8,9.环氧化物,与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)在两相反应体系中实现偶联,得到复合物AFG1-BSA.复合物紫外扫描结果显示其扫描图谱与BSA和黄曲霉毒素G1的图谱有明显差异,同时复合物与BSA荧光强度的差异,这表明BSA与黄曲霉毒素G1偶联.AFG1-BSA中AFGl与BSA的摩尔比为4.29:1.以合成人工抗原免疫小鼠,制备了特异性的鼠抗AFG1多克隆抗血清.用间接ELISA法测得抗体血清的最高效价可达1:16000,并测定了抗体的敏感度以及特异性.     

黄曲霉毒素B1人工抗原的合成及鉴定

采用衍生化在黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1）上引入羧基合成AFB1羧甲基活化物,通过N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimide NHS）法将AFB1O与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA。ECI-MS和紫外光谱法的鉴定结果表明目标半抗原合成成功。结合紫外分光光度法和回归方程,分别测得不同浓度的半抗原和蛋白质线性曲线为：Y=0.1440X+0.0103,R2=0.9986;Y=0.0059X+0.0808,R2=0.9889。偶联物中半抗原和蛋白质的浓度分别为186.32 μg/mL、6127.46 μg/mL,即求得抗原分子结合比为5.13:1,从而为制备抗AFB1抗体奠定基础。     

对硫磷快速ELISA检测方法的建立

由于对硫磷的残留问题及其危害,迫切需要建立一种快速有效的农药检测方法。将对硫磷苯环上的硝基还原为氨基,得到了具有氨基活性的半抗原化合物———氨基对硫磷,然后采用重氮法将氨基-对硫磷与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)相偶联,分别合成了免疫原和包被抗原:氨基对硫磷-BSA、氨基对硫磷-OVA。对合成的抗原进行紫外可见扫描,确证偶联成功。用合成的免疫抗原免疫实验用大白兔,制备对硫磷的多克隆抗血清,效价达到1∶1×106以上。对硫磷抗体除了与甲基对硫磷具有极其微弱的交叉反应以外,与甲胺磷和毒死蜱交叉反应低于0.1%,最低检测限2.0ngg,回收率为93.3%。该方法简便、快速、灵敏,适用性强。     

恩诺沙星完全抗原的合成及其偶联条件的初步优化

采用碳二亚胺法合成了恩诺沙星的完全抗原,通过紫外光谱、激光解析飞行质谱等手段对完全抗原的合成效果进行了分析。以BALB/C小鼠的抗血清效价为指标,利用正交试验对完全抗原制备过程中的几个影响因素进行了优化。结果表明:载体蛋白具有较为明显的影响,其中鸡血清白蛋白(OVA)的效果最好;沙星与蛋白的物质的量比为75∶1,偶联时间为24h。经验证,恩诺沙星完全抗原合成条件的优化筛选取得了预期的效果。     

抗神经性贝毒素PbTx-2单克隆抗体的制备及鉴定

研究采用混合酸酐法将神经性贝毒素PbTx-2与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联制备完全抗原。用免疫原PbTx-BSA免疫8周龄BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经过4次亚克隆获得一株可稳定分泌抗PbTx-2的杂交瘤细胞株4B5,间接ELISA法测得腹水效价为1:5.12×104,抗体亚类为IgM,亲和常数为2.32×107mol/L。     

细交链孢菌酮酸人工抗原的制备

对链格孢霉菌毒素中危害最大的细交链孢菌酮酸进行设计和修饰,系统研究载体、蛋白和偶联方法与条件,结合人工抗原纯化、鉴定的结果,分析影响免疫原合成的各种因素,确定碳二亚胺法偶联细交链孢菌酮酸与牛血清白蛋白可获得偶联比为9.7∶1的人工抗原,能够满足动物免疫需求。     

磺胺喹恶啉人工抗原合成及鉴定

国内首次用重氮化法将磺胺喹恶啉(SQ)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原SQ-BSA和包被抗原SQ-OVA.紫外扫描法与SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定表明偶联成功,偶联比分别为10.1∶1、9.8∶1.将SQ-BSA免疫BALB/C小鼠,获得了高效价、敏感性好的抗SQ血清,表明ELISA方法鉴定偶联成功,为进一步制备抗SQ单抗奠定了基础.     

赭曲霉毒素A人工抗原的合成与鉴定

采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide NHS)法将赭曲霉毒素A(OTA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备了免疫抗原OTA-BSA,采用1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)法将赭曲霉毒素A(OTA)与卵清白蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原OTA-OVA。紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳结果初步表明偶联成功。用OTA-BSA分10μg/只和50μg/只两个剂量分别免疫BALB/C小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗血清,效价可达1∶104,抑制效价达14.7ng,证明偶联成功,并显示低剂量免疫可以提高小鼠pAb的敏感性。本研究为OTA单抗的制备及其免疫学分析方法的建立奠定了基础。