乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。     

牛奶中志贺氏菌PCR检测方法的建立

根据Genbank志贺氏菌侵袭性质粒抗原H (ipaH)基因序列, 自行设计引物, 扩增特异的326 bp核酸片段, 经过优化PCR扩增条件, 建立了志贺氏菌特异、敏感、快速的PCR检测方法, 并对牛奶中的志贺氏菌进行了检测.特异性试验结果表明, 志贺氏菌参考菌株均能扩增出特异的核酸片段, 大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明, 采用试剂盒提取基因组, 该方法的敏感性可达到1.75×102 cfu/mL.人工污染牛奶的模拟检测结果表明, PCR方法的检测限为1.75×103 cfu/mL.     

乳饮料中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立乳饮料中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GeneBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及乳饮料阳性样品中的志贺氏菌进行检测,菌液敏感度可达到2cfu／mL,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测乳饮料中志贺氏菌的需要。     

基于免疫磁分离-双重荧光定量PCR的鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测

目的使用免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法实现对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时、快速检测。方法在37℃的条件下,利用特异性免疫磁球从250 m L循环体系中快速、有效地捕获目标菌。再通过特异性的引物与探针,对沙门氏菌和志贺氏菌进行双重荧光定量PCR检测。结果本研究方法针对鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测限分别达到3.4 cfu/g和9.4 cfu/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度均达到100%。此外,通过对30组实际样品的检测,该方法与传统标准方法的结果保持一致。结论本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测。     

3种食源性致病菌多重PCR检测体系的建立

目的:探究用PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)及志贺氏菌(Shigella spp.)的检测灵敏度,建立快速检测3种食源性致病菌的多重PCR方法。方法:分别依据金黄色葡萄球菌的fem A、沙门氏菌的hil A基因及志贺氏菌的ipa H基因设计3对特异性引物,对3对引物进行多重PCR反应体系构建与优化。结果:建立的多重PCR方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点。结论:研究结果为上述3种食源性致病菌快速检测试剂盒的研发及在食品安全检测工作中的应用提供了重要技术保障。     

二重PCR法快速检测3种食源性致病菌

目的建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)及志贺氏菌属(Shigella spp.)的二重PCR方法。方法分别针对金黄色葡萄球菌.femA和nuc、沙门氏菌属invA和hilA及志贺氏菌属ipaB和ipaH设计6对特异性引物,检测每对引物的特异性及灵敏度,组合优化各自二重PCR反应体系。结果初步建立了针对这3类致病菌的二重PCR检测方法,整个检测过程不超过18 h,检测灵敏度均可达10 pg DNA/reaction。结论所建立的针对3类致病菌的二重PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和方便高效等优点,具有良好的市场应用前景。     

原料乳中志贺氏菌的实时荧光环介导等温扩增技术研究

为了建立原料乳中志贺氏菌快速检测的有效方法,提高志贺氏菌的检出效率。研究根据Gen Bank中志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipa H),设计特异性LAMP引物,将SYBR GreenⅠ荧光染料结合到LAMP扩增技术中,通过实时荧光监测仪优化Mg~(2+)、d NTPs、温度和引物等反应条件,建立了实时荧光环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的反应体系,对纯菌的菌悬液及原料乳人工污染样品中的志贺氏菌进行检测,并对该检测方法的特异性、灵敏度进行了研究,并与普通的LAMP检测方法进行比较。结果表明,该检测方法特异性强灵敏度高,纯菌的菌悬液灵敏度和人工污染样品的检出限都能够达到100 cfu/m L,且灵敏度高于普通的LAMP检测方法。综上所述,研究建立的实时荧光LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短,且检测结果直观易于分析,适用于快速准确监测原料乳中志贺氏菌的污染情况。     

应用DPO技术检测食源性致病菌的多重PCR的研究

DPO是经特殊设计的特异性引物,本研究根据单增李斯特菌的prfA gene、O157的rfb Egene和副溶血弧菌的tlgene和志贺氏菌的ipaH gene设计四对DPO引物,采用多重PCR的方法,建立了检测单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血弧菌和志贺氏菌的快速检测体系。实验结果表明:该体系特异性强,操作简单,为食源性致病菌的检测提供了新型的有效手段。     

反转录-环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌

建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等温条件下,RT-LAMP反应可在30 min内完成。在活菌/损伤菌模型中,该方法表现出比国标法更好的准确性。在23株细菌标准菌株中仅对4株志贺氏菌有特异性检出。志贺氏菌RNA模板的检测灵敏度为7 fg/μL。人工污染脱脂乳样品检测灵敏度达到40 CFU/g,比RT-PCR方法高出2个数量级。表明所建立的志贺氏菌RT-LAMP扩增方法可以准确的检测志贺氏菌,同时具有快速、特异、灵敏的优势,可用于志贺氏菌的快速筛查和现场监控。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测

通过扩增hly基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR方法.该方法具有较强的特异性,35株经传统方法鉴定的菌株PCR结果均为阳性,而其他三种同属异种菌,包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段.PCR方法对上Lm纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl,对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g,牛奶为4CFU/ml.应用该方法对285份食品样品检测,17份样品Lm呈阳性,结果与常规的分离培养方法完全一致.该种方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中Lm的快速检测.     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

乳品中致病大肠杆菌荧光双重PCR技术建立

建立乳及乳制品中致病性大肠杆菌(EPEC)的快检方法。以EPEC特异的微绒毛粘连基因(eae gene)和茵毛束形成编码基因(bfp gene)为模板,设计两对引物,荧光探针对EPEC进行特异性扩增。该方法快速,特异性好,对EPEC的最低检出量为1 cfu/μL(纯菌),检出时间为3 h,同一样品重复检测3次ct值的变异系数均小于5%。建立可快速特异检测乳及乳制品中EPEC的双重荧光PCR方法。     

发酵乳活性双歧杆菌种类快速识别及定量研究

本文建立了发酵乳制品中双歧杆菌种类和数量快速测定方法。以发酵乳中双歧杆菌为靶标,采用PCR-DGGE技术快速识别双歧杆菌种类;采用Real-Tine PCR手段测定双歧杆菌数量。研究结果表明,PCR-DGGE能准确、快速鉴别双歧杆菌种类,检出限为105 CFU/g;Real-Tine PCR能准确、快速定量双歧杆菌,检出限为104 CFU/g。该方法可用于发酵乳中双歧杆菌的快速识别和定量。     

大肠埃希O157:H7等致病菌多重PCR法快速检测试剂盒的研制

目的:研制一种能够同时快速检测大肠埃希O157:H7、志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌的三重PCR试剂盒.方法:以大肠埃希O157:H7的hlyAB基因、痢疾志贺氏菌的IpaH基因和致病性蜡样芽孢杆菌的hblA基因作为目的基因片段O157:H7、痢疾志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌的特异性抗原基因序列,分别设计1对引物,并对其反应条件进行优化,建立1种多重PCR检测试剂盒.结果:本试剂盒可准确检测出生肉和即食肉制品中的上述3种致病菌,O157:H7检出极限为19.8 cfu/mL,志贺氏菌检出极限为17 cfu/mL,蜡样芽孢杆菌检出极限为17.7 cfu/mL.可在5 h内完成全部反应过程,得出检测结果.结论:本试剂盒在理论和实际应用方面均具有优越性,能够同时检测上述3种病原菌,可用于食品及其原料的生物安全检测,也可用于兽医临床诊断.     

肉制品中志贺氏菌DNA的快速提取方法

肉制品中致病菌DNA的提取对PCR检测具有重要意义。以污染志贺氏菌的猪肉为材料,比较了沸水浴法、裂解液煮沸法、CTAB/SDS法、改良的碱性异硫氰酸胍法4种提取方法对志贺氏菌DNA的提取效果,并以提取的DNA为模板进行PCR检测。结果表明:改良的碱性异硫氰酸胍法提取志贺氏菌DNA的效果较好,猪肉中志贺氏菌的PCR最低检出限为5×100CFU/g,整个检测时间<8h。经改良的碱性异硫氰酸胍法操作简便、经济省时,可用于肉类的PCR检测。     

多重PCR快速检测婴幼儿奶粉中的病原菌

为了建立同时检测婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法,根据阪崎肠杆菌ompA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽孢杆菌hblA基因分别设计3对引物进行多重PCR扩增,并对反应条件进行优化。结果多重PCR扩增出长度为514、156、235bp的特异性目的条带。不增菌的情况下,多重PCR同时检测3种病原菌的灵敏度是103cfu/mL,3种病原菌在奶粉中的检出限是104cfu/g。建立的多重PCR反应准确、快速、高效,为同时检测婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌提供了新方法。     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

乳粉中阪琦肠杆菌的PCR检测

针对我国食品进出口和生产卫生的需要,使用以16 S rRNA基因为靶序列设计合成了一对可扩增282 bp的目的片段的引物,建立了检测阪琦肠杆菌的PCR方法.结果表明,阪琦肠杆菌PCR产物有282 bp的特异性片段,而金黄色葡萄球菌无此目的条带,证实该引物具有特异性.该方法快速、可靠、灵敏,特异性强,可用于食品中阪琦肠杆菌的检测.     

食源性致病菌PCR检测中常用的靶基因及其参考引物

PCR方法检测食源性致病菌在敏感性、特异性与速度上都具有很大优势,在其应用过程中,选择的靶基因和由此设计的引物序列直接影响方法的特异性和灵敏性。综述了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及其他常见的食源性致病菌在PCR检测中常用的靶基因及其参考引物,以供相关研究者借鉴。