重金属汞酶联免疫检测方法的建立

建立了重金属汞离子的间接竞争酶联免疫(IC-ELISA)分析方法。由于汞离子不具有免疫原性,因此以异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)为双功能螯合剂连接汞离子和钥孔血蓝蛋白(KLH)作为免疫原,免疫新西兰大白兔获得特异性抗体。用获得的抗体建立汞的ELISA分析方法。检测限为0.45μg/L,灵敏度为4.10μg/L。特异性实验表明,抗体对镍和铜的交叉反应率分别为10.8%和13.5%,与其他金属均无明显交叉反应。本实验以白芷、胡萝卜和皮皮虾为基质,添加回收实验表明,白芷、胡萝卜、皮皮虾回收率均在70%～120%。使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)验证方法的准确性,仪器检测结果和建立的ELISA分析方法具有很好的相关性(相关系数为0.988),表明建立的方法具有很好的准确性。     

双酚A的酶联免疫检测方法的建立

将双酚A（BPA）半抗原与牛血清白蛋白（BSA）共价偶联后,制备兔抗双酚A多克隆抗体,建立了双酚A间接竞争酶联免疫（icELISA）检测方法,并对其进行了方法学评价。结果表明:最佳的抗体稀释度为1∶1600,双酚A竞争标准曲线在0.3～100μg·mL-1之间具有良好的线性关系,最低检测浓度为0.001μg·mL-1,重现性实验变异系数均小于10%。交叉反应实验中,与双酚酸和双酚B的交叉反应率分别为20.0%和10.0%;与双酚E和4-枯基苯酚的交叉反应率均在5%以下。水样的添加回收实验,回收率范围为92.5%～107.7%。      

双酚A的酶联免疫检测方法的建立

将双酚A(BPA)半抗原与牛血清白蛋白(BSA)共价偶联后,制备兔抗双酚A多克隆抗体,建立了双酚A间接竞争酶联免疫(icELISA)检测方法,并对其进行了方法学评价。结果表明:最佳的抗体稀释度为1∶1600,双酚A竞争标准曲线在0.3～100μg·mL-1之间具有良好的线性关系,最低检测浓度为0.001μg·mL-1,重现性实验变异系数均小于10%。交叉反应实验中,与双酚酸和双酚B的交叉反应率分别为20.0%和10.0%;与双酚E和4-枯基苯酚的交叉反应率均在5%以下。水样的添加回收实验,回收率范围为92.5%～107.7%。     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

沙丁胺醇药物残留酶联免疫检测法的建立及优化

本试验通过优化ELISA工作条件,建立间接竞争ELISA检测沙丁胺醇(SAL)的方法。采用方阵滴定法确定包被抗原、抗体、酶标二抗的工作浓度;以上述试验条件为基础,以系列稀释的SAL标准溶液作为检测对象,绘制标准曲线,并最终确定优化的试验方案。方阵滴定法确定包被抗原工作浓度为1:2000,抗体工作浓度为1:4000,酶标二抗工作浓度为1:6000;从标准曲线可知,线性检测范围为0.5～20 ng/mL,IC50为2.33 ng/mL;最终优化的试验方案中酶标板为深圳金灿华有限公司的产品,包被液为0.05 mol/LpH 9.6的碳酸盐缓冲液,封闭液为1%BSA+PBST,标准品用复溶液配制,抗体稀释液为1号,酶标二抗稀释液为3号,显色时间为15 min。本研究建立了一种灵敏、特异、操作简单、适于大批量样品筛选的SAL检测方法,对其他药物残留免疫学快速检测产品的研制及应用也有一定的借鉴意义。     

新霉素酶联免疫检测方法的研究——新霉素抗体的制备

以碳化二亚胺作为偶联剂,分别将新霉素(Neomycin,NEO)和牛血清白蛋白(Bovine serum albu-min,BSA)、血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)进行偶联,得到偶联产物BSA-NEO和KLH-NEO。对BSA、KLH、NEO及其偶联产物BSA-NEO、KLH-NEO进行红外光谱分析,结果显示偶联产物的红外光谱中同时存在载体蛋白和NEO的特征吸收峰,初步证明偶联成功;将偶联产物BSA-NEO和KLH-NEO作为新霉素免疫抗原,分别免疫新西兰大白兔,成功获取新霉素抗血清,间接ELISA法测得抗血清效价可达1.28×105以上。     

食品中苏丹红I酶联免疫检测方法的建立及酶学性质研究

为了检测食品中非法添加物苏丹红,采用重氮化法合成了2种苏丹红Ⅰ的衍生物,通过液相色谱-质谱(LC/MS)鉴定后,分别将两种衍生物与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)以及卵清蛋白(OVA)偶联制备完全抗原。紫外光谱表征结果证明衍生成功。将制备的BSA络合物做为免疫原免疫兔子,制备了多克隆抗体。采用方阵法确定了抗体和包被抗原的稀释比例。对影响酶免疫检测方法(ELISA)的因素包括包被液,封闭液,样品稀释液,抗体稀释液,反应时间等进行了优化。在最适反应条件下,以苏丹红质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标建立了抑制曲线,线性范围为0.3~23.4 ng/mL,苏丹红Ⅰ的半数抑制率(IC50)为3.0 ng/mL,检测限(LOD)为0.1 ng/mL。交叉反应测试表明,与对位红交叉反应率为140%;与苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红G的交叉反应率分别为1.1%,6.85%,6.5%;与苏丹红Ⅳ的交叉反应率<0.1%。以辣椒粉为样本,在5 ng/g和20 ng/g添加水平下得到回收率分别为90.4%和96.0%,变异系数分别为1.8%和4.9%。     

除草剂异丙甲草胺特异性抗体制备及免疫检测方法的建立

为检测食品中的异丙甲草胺农药残留,降低其对人体可能造成的危害,本文建立了基于抗体的酶联免疫分析方法。首先以除草剂异丙甲草胺、3-巯基丙酸为原料合成半抗原,经由氢核磁共振和质谱方法鉴定后,通过碳二亚胺（EDC）法将半抗原与载体蛋白偶联制备异丙甲草胺人工抗原,免疫新西兰大白兔获取抗体,通过棋盘滴定确定抗原抗体最佳稀释倍数,ELISA反应的抗体稀释液为PBS（1% PEG 6000）,药物稀释液为PBS（10%甲醇）,在此基础上建立间接竞争ELISA标曲,其IC50为14.64 ng/mL,检测限（limit of detection,LOD）为0.8 ng/mL,线性检测范围IC20~IC80为1.51~141.92 ng/mL。与14种结构类似物进行交叉反应,交叉反应率低于3%。向环境水样中添加异丙甲草胺,回收率为86.60%~102.16%,变异系数（RSD）为7.05%~13.30%。此抗体灵敏度高特异性好,可用于食品和环境中异丙甲草胺的监测。     

沙丁胺醇直接酶联免疫快速检测的方法

沙丁胺醇与瘦肉精同属于禁用的饲料添加剂,可以在动物体内大量残留,人体过量摄入会引起中毒反应。为了建立沙丁胺醇的快速检测方法,从硫酸沙丁胺醇出发制备了半抗原沙丁胺醇丁二酸衍生物,用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白-钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联作为免疫抗原制备了沙丁胺醇的多克隆抗体,建立了沙丁胺醇直接竞争酶联免疫检测方法,该方法抗体最佳包被抗体量为1μg/孔,酶标抗原稀释比例为1∶16000,掩蔽剂采用脱脂奶粉。所建立的方法具有很高的灵敏度和特异性I,C50为0.90ng/mLI,C15达到了0.05ng/mL,远低于国家残留限量标准,与沙丁胺醇的结构类似物基本没有交叉反应。     

免疫偶联物设计、合成及间接ELISA方法快速检测纯净水中双酚A的研究

设计并合成了双酚A（BPA）的免疫抗原和包被抗原,制备抗BPA多克隆抗体,并建立了间接ELISA方法用于检测瓶装纯净水中BPA的残留。首先,合成了免疫抗原DPA-BSA,并免疫新西兰大白兔得到抗BPA多克隆抗体。其次,合成结构与DPA-OVA有较大差别的包被抗原HPPA-OVA作为\     

间接竞争酶联免疫法检测水样中的重金属镉

利用重金属镉多克隆抗体,建立一种低仪器成本的检测水样中重金属镉的间接竞争酶联免疫法,其检测限(IC15)为0.76μg/L,灵敏度(IC50)为11.33μg/L。交叉反应结果表明,该抗体除与汞螯合物的交叉反应率为10.9%,与其他金属(锰,铬,镁,铁,铅,镍,银和铜)螯合物的交叉反应率均低于1.32%。自来水和河水样品中镉的添加回收率为93.95%～107.40%,变异系数为3.97%～14.69%。     

牛乳铁蛋白的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法的建立

用牛乳铁蛋白(Bovine Laetoferrin，BLf)、纯品免疫新西兰白兔制得兔抗BLf的多克隆抗体，琼扩效价最高为l：64。经ELlSA方法检测，该抗体与牛乳中的主要蛋白质：α—乳清蛋白、β—乳球蛋白、血清白蛋白以及酪蛋白之间不存在免疫交叉性，说明抗体特异性良好。以BLf纯品为包被抗原，自制抗体为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG为二抗，邻苯二胺(OPD)为底物，建立了BLf的竞争抑制性ELISA方法。包被抗原及抗体的浓度均由方阵稀释实验确定。所建立的ELlSA方法孔间误差1．6％，板间误差4．3％，灵敏度25μg／L，检测范围25～800μg／L。标缝曲线线性方程（Logit）Y=-1.488IgC 3.8116，相关系数R=0.990。     

测定食品中呋喃它酮代谢物3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫吸附法

目的建立以多克隆抗体为基础的测定食品中呋喃它酮代谢物3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的间接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)。方法以4-甲酰基苯氧基乙酸(4-FPA)为修饰剂,合成AMOZ半抗原衍生物,并使其分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)交联制备得到免疫原和包被抗原,经免疫动物(兔),获得抗NPAMOZ(AMOZ与衍生化试剂2-硝基苯甲醛所形成的结合物)的多克隆抗体。用酶联免疫分析法测定AMOZ(以NPAMOZ形式)。结果在包被抗原为2.5ng/mL,抗体为1:300000稀释,酶标二抗为1:10000稀释的优化条件下,ELISA测定AMOZ(以NPAMOZ形式)的IC50值(标准曲线中吸光度抑制至最大吸光度值50%时所对应的待测物浓度)为1.86ng/mL。抗体与呋喃它酮的交叉反应率较高(70.7%),与AMOZ的交叉反应率仅为0.32%,与其余三种硝基呋喃抗生素及它们的代谢物以及其它八种药物的交叉反应率很小(0.01%),表明抗体的特异性高。四种市售的肉样(鱼肉、虾肉、鸡肉、猪肝)用作加标实验,加标浓度分别为0.5、1.0和5.0ng/g,加标样品经衍生化处理后用ELISA测定,回收率为75.6%~112.2%,批间相对标准偏差(RSD)为8.3%~17.5%。结论本法具有高灵敏性和高特特异性,能用于动物产品中AMOZ的检测。     

呋喃西林代谢物多克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法

为了建立检测呋喃西林代谢物(SEM)的酶联免疫吸附分析方法(ELISA),将所设计合成的系列半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原并免疫新西兰大白兔,筛选获得源于新颖半抗原H3的具有高亲和力、高特异性抗SEM多克隆抗体。同时,基于设计合成的系列同/异源包被抗原,考察了不同结构包被原对ELISA灵敏度的影响,发现H4-OVA作为异源包被原建立SEM的ELISA检测方法可获得最佳的检测效果,结果显示:ELISA方法的半抑制浓度(IC50)为12.37ng/mL;定量检测线性范围(IC20～IC80)为0.439～110.78ng/mL;检测限(IC10)达0.07ng/mL,达到了国内外相关检测限量要求,可应用于实际食品样品检测。     

Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for diniconazole in agricultural samples

Diniconazole hapten was synthesized and conjugated to bovine serum albumin (BSA) by the carbodiimide method to produce an immunogen and to ovalbumin (OVA) by mixed anhydride method to produce a coating antigen. Polyclonal antibody against diniconazole was generated by immunizing New Zealand rabbits with the immunogen. Under optimised conditions (20% methanol, 0.4 mol/L Na⁺, pH 7.5), an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) was developed for detecting diniconazole. The 50% inhibitory concentration (IC₅₀) was 0.071 ± 0.013 mg/L and the limit of detection (LOD) was 1.28 ± 0.80 μg/L. Triazole fungicide analogues of diniconazole were tested and did not obviously cross-react, except for uniconazole (2.25%). The recoveries obtained after addition of standard diniconazole to agricultural samples, including water, soil, pear, grape, tomato and wheat flour, ranged from 70% to 120%. The ic-ELISA developed could successfully be applied to analysis of diniconazole residues in agriculture samples.     

A sensitivity-improved enzyme-linked immunosorbent assay for fenvalerate: a new approach for hapten synthesis and application to tea samples

BACKGROUND: Fenvalerate has been widely used for the control of many common pests, but residues of this pesticide have been found in some agricultural crops. China is a large exporter of tea products; thus monitoring of pesticide residues in tea products has become increasingly important. In this study, a method of competitive direct enzyme‐linked immunosorbent assay (CD‐ELISA) for the rapid detection of fenvalerate in tea sample was developed. RESULTS: A polyclonal antibody against fenvalerate (FEN) was produced by the hapten with the characteristic moiety of fenvalerate. After acidification, the hapten was synthesized from 2‐(4‐chloro‐phenyl)‐3‐methyl‐butyric acid and aminocaproic acid methyl ester. The CD‐ELISA method developed has a high sensitivity of detection: 9 µg L^?1 for IC₅₀ and 0.5 µg L^?1 for IC₁₅. Fenvalerate was treated with 0.5 mmol L^?1 NaOH–methanol solution to improve its solubility by isomerization. In the tea sample, the detection limit of fenvalerate was 0.16 mg L^?1. A recovery rate of 76.67–91.43% was obtained from spiked tea. The reliability of the CD‐ELISA method is better in comparison with the gas chromatographic method (R² = 0.9968). CONCLUSION: In this study, a simple and efficient immunoassay method was developed. It is preferable for the rapid determination of fenvalerate residues in tea samples. Copyright © 2011 Society of Chemical Industry     

Application of competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay (Ci-ELISA) for monitoring the degree of frozen denaturation of bovine myosin

The denaturation of myosin on freezing and frozen storage was monitored using competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay (Ci-ELISA) formatted with polyclonal antibodies anti-MWM IgG, anti-S-1 IgG and anti-LMM IgG raised against the antigens (Ags) bovine myosin whole molecules (MWMs), heavy meromyosin S-1 (myosin head part, S-1) and light meromyosin (myosin tail part, LMM) respectively. Beef slices and cuts stored at −20 °C or −50 °C lost immune affinity with all antibodies, in particular anti-LMM IgG. Repeated thawing–refreezing treatment caused more myosin denaturation than simple freezing. Myosin from beef stored at −20 °C was denatured more than that stored at −50 °C. The immune affinities between anti-LMM IgG and thawed samples were similar to those from anti-MWM IgG. We were unable to differentiate reliably between fresh and thawed beef using anti-S-1 IgG. Myosin was denatured by freezing, in particular its tail part (LMM).     

耐受重金属铅乳酸菌的分离筛选及鉴定

通过对包头尾矿库区、白云鄂博采矿区重金属污染严重区域土壤样品中的乳酸菌进行分离、筛选,共得到62株乳酸菌,并对分离得到的乳酸菌进行耐受铅离子的测定,62株乳酸菌对铅离子均有一定的耐受能力,不同菌株对铅离子的耐受能力有所不同;铅离子浓度为1200⁹600 mg/L时,随着培养时间的增长,菌株对耐受铅离子的修复能力逐渐增强;30℃下分离得到的菌株对铅离子的修复能力明显优于37℃下分离得到的菌株;菌株BY-Fa4、BG-5b3、BG-8b2等13株菌可在铅离子浓度为7200 mg/L的环境下生长,菌株BY-Fa1、BY-Fc2、BG-6b1可在铅离子浓度为8400 mg/L的环境下生长。实验结果得出筛选得到的13株乳酸菌对铅离子不仅具有较强的耐受能力,而且还具有较强的修复能力。对筛选出13株高耐受铅离子的菌株进行16S rRNA序列分析,鉴定结果为戊糖片球菌2株、清酒乳杆菌1株、食窦魏斯氏菌5株、戊糖乳杆菌2株、植物乳杆菌3株。      

ELISA法测定热加工食品中的丙烯酰胺

该研究建立了热加工食品中丙烯酰胺的间接竞争ELISA检测方法.首先用戊二醛法合成丙烯酰胺-BSA免疫抗原,注入兔体内以产生抗丙烯酰胺多克隆抗体.结果显示,在包被抗原为1.5μg/mL,抗体稀释度为1∶16000倍的优化条件下,间接ELISA法检测范围为50μg/L～1280μg/L,IC50为检测限为350μg/L,最低检测限为50μg/L.加标回收率为92.6%～95.5%.该检测方法准确快速,特异性强,适用于热加工食品中丙烯酰胺的快速检测.