抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及免疫学鉴定

通过碳化二亚胺法(EDC法)制备免疫原OTA-BSA,并免疫小鼠,经杂交瘤技术建立产抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株。通过体内诱生腹水法制备腹水,纯化后对其亚型、效价、灵敏性、亲和性、特异性等免疫学特性进行鉴定;单抗亚类为IgG1型,间接ELISA效价1:6.4×105,IC50为112.8pg/mL,亲和常数为9.74×1011L/mol,与赭曲霉毒素B交叉反应率为5.6%,与其他常见真菌产物交叉小于0.003%;本实验制备的抗OTA单克隆抗体具有高效、敏感、特异等特点,适合OTA的免疫学快速检测。     

质谱法测定4种真菌毒素与载体蛋白偶联物的结合比

采用基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)对由3种真菌毒素伏马菌素B1(FB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与两种载体蛋白卵清白蛋白(OVA)、血清白蛋白(BSA)分别偶联制备得到的4种小分子-载体蛋白偶联物FB1-OVA、FB1-BSA、OTA-BSA、DON-OVA的偶联结合比进行测定,并与紫外吸收光谱法进行比较。基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱法测得偶联物FB1-OVA、FB1-BSA、OTA-BSA、DON-OVA的结合比分别为5:1、11:1、3:1、0;紫外吸收光谱法测得OTA-BSA的结合比为4.4:1,DON-OVA的结合比为3.4:1,无法测定FB1-OVA、FB1-BSA结合比。     

抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

为了制备赭曲霉毒素A多克隆抗体,采用戊二醛法合成赭曲霉毒素A-BSA人工抗原,通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白偶联效果.合成的人工抗原用弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小白鼠,4次免疫后眼球下缘采血,分离血清.试验结果表明,免疫后产生了抗赭曲霉毒素A-BSA的特异性多克隆抗体,抗体效价为1:8100,赭曲霉毒素A的最低...     

免疫亲和柱——高效液相色谱法测定肾脏中的赭曲霉毒素A

目的针对动物肾脏中可能污染的赭曲霉毒素A(OTA),建立了肾脏中赭曲霉毒素A的高效液相色谱方法。方法试样用磷酸酸化后经乙酸乙酯提取,免疫亲和柱净化,以乙腈-水-冰醋酸(450+525+25)为流动相,C18柱分离并通过荧光检测器定量。结果赭曲霉毒素A标准溶液浓度在0.10～20μg/L范围内呈线性相关(r=1.000 0),不同浓度水平的添加回收率为72.5%～87.4%,检出限为0.012μg/kg。结论使用免疫亲和柱净化能够达到良好的净化效果,是一种准确、方便的测定猪肾中赭曲霉毒素A的分析方法。     

高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中的 赭曲霉毒素A

目的建立高效液相色谱-串联质谱联用技术检测茶叶中赭曲霉毒素A(OTA)的方法。方法用甲醇-2%Na HCO3溶液(60:40,V:V)提取样品中的赭曲霉毒素A,采用免疫亲和柱对茶叶中的赭曲霉毒素A净化,使用甲醇-5 mmol/L乙酸铵(含0.1%乙酸)为流动相,检测赭曲霉毒素A,采用正离子模式。结果本方法中赭曲霉毒素A在0.5~10 ng/m L质量浓度范围内具有良好的线性关系(r=0.996),回收率在83.6%~92.5%之间,相对标准偏差在6.5%~9.1%之间,检出限为0.1μg/kg。结论该方法准确性好、灵敏度高,适用于茶叶样品的检测。     

基于吖啶酯-磁微球的自动化学发光免疫法检测赭曲霉毒素A

该研究建立了一种基于吖啶酯-磁微球的自动化学发光免疫法（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA）检测牛奶中的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）。采用磁微球偶联二抗,吖啶酯标记OTA-BSA偶联物,优化了磁微球浓度、OTA抗体浓度、吖啶酯标记物浓度、抗体和标记物稀释液、反应时间、样品预处理条件等各种CLIA方法的试验条件。结果表明,CLIA方法对OTA的检出限为6.38 ng/kg,半抑制浓度（IC50）为31.40 ng/kg,线性范围为11.23~99.20 ng/kg,批内和批间的变异系数<8%;测定牛奶样品中的OTA时,检出限为25.52 ng/kg,IC50为125.60 ng/kg,线性范围为44.92~396.80 ng/kg,添加回收率为95.08%~105.83%;对赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C的交叉反应率为6.52%和24.57%,对其他真菌毒素均无明显的交叉反应;对牛奶样品的检测结果与高效液相色谱-串联质谱法一致;且CLIA方法的试剂能在2~8 ℃稳定保存9个月以上。该研究建立的CLIA方法,具有灵敏、准确、快速和操作便捷等特点,检测时长仅30 min,尤其适用于大规模牛奶样品中OTA残留的快速筛查。     

药食两用类食品中赭曲霉毒素A的高效液相色谱-荧光检测方法

目的:采用免疫亲和净化和高效液相色谱技术,建立淀粉、糖类药食两用食品中赭曲霉毒素A的测定方法。方法:样品粉末经甲醇-水(8:2,V/V)涡旋、超声及振摇提取,提取液以磷酸盐缓冲液稀释后,用商品免疫亲和柱净化,含有赭曲霉毒素A的甲醇洗脱液用高效液相色谱技术分析,C18反相色谱柱分离,荧光检测器测定。结果:赭曲霉毒素A的最低检出浓度为1.0μg/kg(RSN=3);在0.5～100ng/mL范围内,峰面积与质量浓度呈线性关系(r=0.9995);以不含赭曲霉毒素A的太子参、莲子、薏苡、麦冬和龙眼肉为加标基质,加标水平为1～8μg/kg时,平均回收率在81.8%～107%之间,RSD为1.66%～15.0%(n=3)。结论:免疫亲和柱能和高效液相色谱-荧光检测相结合取得较为满意的结果,准确度高、精密度好,满足欧盟对食品饲料中OTA检测方法的要求,适合于淀粉、糖类药食两用食品中赭曲霉毒素A的测定。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原和多克隆抗体的制备

对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的两种半抗原合成方法进行对比研究,合成半抗原,并采用活化酯法将半抗原与牛血清白蛋白偶联制备得到免疫原,通过特定程序免疫日本大耳白兔获得了多克隆抗体.抗血清效价为1∶32 000,proteinA-sepharose 4B 亲和层析纯化的DON抗体与DON、3-AC-DON(3-乙酰氧基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、15-AC-DON(15-乙酰氧基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、T-2毒素、OTA(赭曲霉A)、ZEN (玉米赤霉烯酮)的交叉反应率分别为:100%、500%、2.50%、0.10%、0.01%、0.01%,表明了所制备DON抗体的高特异性.     

全自动免疫亲和在线净化—高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A

建立了全自动免疫亲和在线净化-高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A(Ochtatoxin A,OTA)的方法。玉米、小麦样品经乙腈-水(60:40,V:V)提取,3%Tween-20(m/V)水溶液10倍稀释后,用自动进样器注入RIDA~? REST在线固相萃取系统,经赭曲霉毒素A免疫亲和小柱净化后,以乙腈-2%乙酸水(50:50,V:V)为流动相,流速为1.0 mL/min,C18色谱柱(150 mm×3.5 mm,3.5μm)分离,荧光检测器测定。根据3倍信噪比的峰响应值,确定赭曲霉毒素A的检出限为0.24μg/kg,在0.012 5～0.5μg/L范围内呈线性相关,R~2值为0.999 8;在玉米、小麦样品中加标回收率为80.1%～106.9%,变异系数为2.4%～8.2%。本方法一次装柱可检测60个样品,24 h可检测100个样品,满足谷物中赭曲霉毒素A快速准确定量检测的需要。     

甲硝唑人工抗原的合成及鼠源多抗的制备

为了获得效价高、特异性好的甲硝唑（metronidazole,MNZ）的小鼠多抗血清,采用琥珀酸酐法将甲硝唑上的羟基改造成羧基,然后通过碳二亚胺法把改造后的甲硝唑分别与牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,制备免疫原MNZ-BSA和包被原MNZ-OVA。经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步鉴定偶联成功。将免疫原MNZ-BSA分成20 μg/只和50 μg /只2 个剂量分别免疫8 周龄的BALB/c小鼠。获得了效价高、特异性好的小鼠多抗血清,效价均达到1∶104以上,IC50值为61.39 ng/mL。