国产沙门氏菌免疫磁珠的制备及其应用

目的优化免疫磁珠制备条件,获得捕获性能高、成本低的国产沙门氏菌免疫磁珠,为国产沙门氏菌免疫磁珠的产业化制备奠定基础。方法采用亚微米级羧基磁珠及沙门氏菌多克隆抗体,利用碳二亚胺缩合法制备2 mg级免疫磁珠。以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率为评价指标,对4种粒径(100、300、500、1000 nm)的磁珠原材料进行筛选;以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率、免疫磁珠表面FITC荧光强度为评价指标,对磁珠与抗体不同的投料比(100:1、100:1.5、100:2、100:2.5、100:3)进行优化;同时,对国产沙门氏菌免疫磁珠与进口免疫磁珠(Dynalbeads~?沙门氏菌免疫磁珠、Bac Trace~?沙门氏菌免疫磁珠)的性能进行比较分析,考察了捕获率、免疫磁珠与目标菌的结合情况、特异性捕获能力等,并在实际样品中进行了应用检测。结果以粒径为300 nm的磁珠为原材料制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/mL的目标菌的捕获率为99%、抗体偶联率为34.64%,明显高于其他粒径的免疫磁珠;当投料比为100:2(磁珠:抗体)时,制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/m L的目标菌的捕获率为100%,偶联率为52.34%,优于其他投料比;针对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(10~0~10~6 CFU/mL),国产免疫磁珠的捕获率高于进口免疫磁珠(国产:83%~100%;Dynalbeads~?:57%~74%;Bac Trace~?:9%~40%);在25 mL牛奶中添加(11.9±3.7)CFU鼠伤寒沙门氏标准菌株,国产沙门氏菌免疫磁珠的检出率高于进口免疫磁珠(国产:100%;Dynalbeads~?:70%;Bac Trace~?:40%)。结论优化了制备条件后所制备的国产沙门氏菌免疫磁珠的捕获能力强、价格低、能够实现大体积实际样品中痕量目标菌的100%检出,具有广阔的应用前景,本研究为沙门氏菌免疫磁珠的国产化应用提供了科学数据。     

免疫磁珠分离技术在食源性致病菌检测中的应用

免疫磁珠(immunomagnetic beads, IMB)是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子, 由载体微球和免疫配基结合而成。免疫磁珠分离技术(immunomagnetic beads separation techniques, IMBS)则是利用免疫磁珠上包被的特异性抗体与抗原发生亲和反应, 从复杂的样品中分离到目标抗原。再利用磁珠的磁响应性, 实现对目标抗原的富集。在食源性致病菌检测方面, 该技术通过与其他检测手段相结合而得到广泛应用, 具有灵敏度高、检测时间短、操作简单等优势。本文综述了免疫磁珠的结构特点、免疫磁珠分离技术的原理, 着重阐述了该技术在食源性致病菌检测方面的应用进展, 以期为免疫磁珠分离技术的广泛应用提供参考。     

基于免疫磁珠快速分离金黄色葡萄球菌的研究

通过实验优化建立基于免疫磁分离技术对金黄色葡萄球菌的快速分离方法,为后续快速检测提供基础.利用金黄色葡萄球菌多抗制备的免疫磁珠对其捕获.结合平板菌落计数,考察包被磁珠时多抗加入量、免疫磁珠加入量及捕获时间等因素对捕获效率的影响.在单因素实验基础上进行正交实验,并对该方法的灵敏度、特异性及其在食品中的应用效果初步探索.结果表明,最佳捕获条件为抗体加入量30μL,免疫磁珠加入量80μL,捕获时间45min,在此条件下捕获效率均超过30％,该方法捕获限可达到101CFU/mL,特异性良好,并初步用于羊肉卷洗水中金黄色葡萄球菌的快速分离,捕获时间小于1h.免疫磁分离作为一种快速的分离筛选方法,可用于食源性金黄色葡萄球菌的快速分离.     

免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌条件的研究

目的:确定免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌的方法和条件。方法:通过对免疫磁珠添加量、免疫磁珠和菌液反应时间的研究,确定了最佳的免疫磁珠富集食源性鼠伤寒沙门氏菌条件和方法,并对免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌敏感性和特异性进行了验证实验。结果:免疫磁珠添加量为100μL、免疫磁珠与菌液反应30 min时,免疫磁珠对鼠伤寒沙门氏菌的富集分离效果最佳,免疫磁珠在该条件下,对鼠伤寒沙门氏菌敏感性和特异性较好。结论:建立了最佳的免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌的方法和条件。     

新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用

分别介绍量子点、荧光微球、上转磷光、纳米磁珠为代表的新型标记物免疫层析,非免疫学层析,替代抗原层析等新型层析快速检测技术,综述其原理、优势及其在食品安全相关领域的应用现状,并对今后层析检测方法的发展趋势进行展望.     

免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法建立

目的:制备高效且特异性好的阪崎克罗诺杆菌抗体及其免疫磁珠,建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的方法。方法:制备阪崎克罗诺杆菌混菌抗体及其免疫磁珠,对免疫磁珠分别在纯培养及奶粉基质中的捕获率进行研究,利用MALDI-TOF MS对不同奶粉基质中不同杂菌污染条件下的检测样本进行鉴定并验证免疫磁珠的特异性。结果:阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠在纯培养条件及奶粉基质中对4株阪崎克罗诺杆菌及其混菌的捕获率均>80%,联合MALDI-TOF MS鉴定结果显示在奶粉基质中不同杂菌污染条件下具有较好的鉴定结果,即使在高比例（1:100）杂菌污染条件下,仍能准确鉴定奶粉中阪崎克罗诺杆菌,此时检测样品中阪崎克罗诺杆菌浓度仅为20 CFU/mL。结论:本研究建立了一种操作简便、鉴定结果准确的免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法,为奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速准确鉴定提供了新的方法参考。     

免疫磁珠法富集沙门氏菌的优化及应用

采用活泼酯法将磁珠和抗体偶联,制备沙门氏菌免疫磁珠,系统地优化了偶联条件和免疫磁珠捕获工艺.结果表明,最佳偶联条件:每毫克磁珠抗体偶联量为50μg,免疫磁珠的添加量为0.4mg,菌液浓度为102～106 CFU/mL时,捕获效率为65％～82％;免疫磁珠捕获工艺:目的菌最佳孵育时间为45min,最佳磁分离时间为3min,磁场强度为0.8T,磁珠粒径为180nm;对鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的捕获效率分别为61.4％、45.8％、48.2％、78.5％、64.1％,对鸡蛋清、蛋黄、牛奶和纯培养基中沙门氏菌捕获效率分别为44.3％、43.2％、65.2％和72.5％.免疫磁分离富集技术具有分离速度快、操作简单、捕获效率高、可重复性好等特点,可在食品样品预处理中广泛应用.     

免疫磁珠技术分离检测熟制食品中的蜡样芽孢杆菌

目的 建立一种免疫磁珠技术分离富集熟制食品中的蜡样芽孢杆菌。方法 在一定量的蜡样芽孢杆菌体系中优化免疫磁珠与抗体用量以及最佳反应时间。在最佳实验条件下, 对免疫磁珠分离蜡样芽孢杆菌的敏感性和特异性进行实验, 并对实际熟制食品的蜡样芽孢杆菌进行分离。结果 最终确定了蜡样芽孢杆菌抗体添加量50 μg/mL、免疫磁珠添加量100 μL, 免疫磁珠与菌液最佳作用时间为15 min, 当菌液稀释度达到10?7, 免疫磁珠法仍然可以检出, 相应的细菌数为4 CFU/mL。结论 本实验制备的免疫磁珠技术灵敏性高, 特异性好, 节省了检测时间和费用, 适用于食品中的蜡样芽孢杆菌的检测。     

一种检测活的非可培养状态空肠弯曲菌的新方法

为提高活的非可培养状态空肠弯曲菌的检出率,建立了一种免疫磁珠捕获-荧光聚合酶链式反应法。该法包括应用免疫磁珠技术制备弯曲菌免疫磁珠,以直接捕获受检样品中的空肠弯曲菌,并设计了检测空肠弯曲菌马尿酸酶(hipO)基因的引物与荧光标记探针。结果表明:磁捕获-荧光聚合酶链式反应法可直接检测空肠弯曲菌,无需增菌培养,具有灵敏度高、选择性好、简便、快速等特点,可在24h内完成样品中活的非可培养状态空肠弯曲菌的检测。     

免疫学技术在食源性微生物检测中的应用综述

对酶联免疫吸附技术、免疫层析技术、免疫磁珠分离技术、酶联荧光免疫分析技术、化学发光免疫分析技术以及免疫传感器技术在食品安全检测中的应用进行了综述,并指出食品中待检靶抗原的筛选与纯化、免疫学检测方法的合理应用,以及敏感性和特异性这2个相矛盾的方面的统筹提高等问题有待解决.     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。     

Rapid detection of Listeria monocytogenes using fluorescence immunochromatographic assay combined with immunomagnetic separation technique

To ensure the safety and quality of food ingredients, especially meat and dairy products, a high‐throughput, rapid and sensitive method to detect Listeria monocytogenes (LM) is always on a high demand. In this work, a specific induction method to enrich and detect LM based on fluorescence immunochromatographic assay (FICA) combined with immunomagnetic separation (IMS) techniques has been developed. The immunomagnetic‐beads (IM) beads were obtained through functionalised magnetic microspheres and the conjugated reaction between the carboxyl on beads surface and amino groups of antibody. The prepared IM‐beads could be used for rapidly enriching pathogenic bacteria with fewer steps, resulting in a high specificity for four pathogenic serotypes and about a 40‐fold improvement of detection limit compared with FICA only. In addition, this method was successfully applied in LM detection in sausage, pork and milk samples with a potential for further application in rapid on‐site detection of pathogenic bacteria.     

免疫磁珠高通量自动净化-超高效液相色谱法测定粮食中玉米赤霉烯酮

基于免疫磁珠高通量自动净化的前处理方法,使用超高效液相色谱仪对粮食中玉米赤霉烯酮的含量进行测定。首先将免疫磁珠与玉米赤霉烯酮的反应时间、样品提取液和不同粮食基质的净化效果进行优化。经方法验证,超高效液相色谱的检出限和定量限分别为3.5 μg/kg和12.0 μg/kg。在优化条件下,全麦粉和玉米全粉阴性样品的3 个添加水平的加标回收率在99.04%～109.26%之间,变异系数不大于6.88%。玉米全粉、全麦粉、糙米粉、小麦粉等粮食基质中玉米赤霉烯酮成分的国家有证标准物质或质控样品的测定结果在标准值及其扩展不确定度范围内,变异系数不大于3.54%,测定结果较为满意。采用Bland-Altman法对免疫磁珠净化法和免疫亲和柱净化法之间的差异进行分析,结果显示这2 种净化方法的差异在可接受范围内,因此,这2 种方法在净化和富集粮食中玉米赤霉烯酮时可互相代替使用。免疫磁珠净化方法配套使用的真菌毒素全自动净化仪可同时净化10～24 个样品,平均每个样品的净化时间约为2～3 min,实现粮食中玉米赤霉烯酮的高通量自动净化。超高效液相色谱分析速度快、灵敏度高、准确性高,可用于检测粮食中玉米赤霉烯酮的含量。     

免疫磁分离技术在食源性致病菌前处理中的应用进展

食源性致病菌污染是造成食品安全问题的主要原因,开发高效的样品前处理方法是对食源性致病菌快速、精准、高灵敏检测至关重要。基于免疫磁珠的免疫磁分离技术具有分离速度快、特异性强等优势,是实现食品中致病菌精准识别和分离富集的有效手段。本文主要综述了免疫磁分离技术及其在食源性致病菌样品前处理中的应用。首先,介绍了免疫磁分离技术的基本原理,讨论了影响磁分离效率的主要因素。其次,总结了免疫磁分离技术与各种检测方法相结合在食源性致病菌检测中的应用。然后,简要阐述了磁性金属有机框架作为新型磁分离材料在样品前处理领域的巨大应用潜力。最后提出了免疫磁分离技术面临的挑战以及未来的发展方向。本文将有助于进一步了解免疫磁分离技术在食源性致病菌分离和富集中的应用,并为免疫磁分离技术在食源性致病菌快速检测中的综合应用提供参考。     

以金属有机框架材料为基质免疫磁珠的制备及在玉米样品检测中应用

采用反相微乳液法,依据金属-有机框架材料一磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)氯化锌水凝胶可以固定蛋白的原理,通过在纳米四氧化三铁磁珠表面包覆AMPZnCl_2水凝胶并偶联抗体,制备了一种新型的水凝胶免疫磁珠。选取了玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)单抗来制备水凝胶免疫磁珠-Fe_3O_4@AMPZnCl_2·ZEA单抗磁珠,对c样品玉米粉进行了ZEA添加回收率测定,添加回收率在84. 81%～90.00%之间,相对标准偏差为4.86%～9.44%;比较了Fe_3O_4@AMPZnCl_2·ZEA单抗磁珠与DZTMSPREP免疫亲和柱对6种玉米粉中ZEA的纯化效果,测定结果和使用免疫亲和柱检测结果保持一致,说明该材料可应用于实际样品的纯化。     

Immunomagnetic separation of Salmonella from foods.

Salmonella could be separated from different inoculated foods using antibody-coated immunomagnetic beads. When applied on suitable foods, the immunomagnetic separation technique showed a sensitivity of 10-20 Salmonella cells/g of the original sample. The technology appeared less useful for some food items.     

免疫磁珠捕获PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

利用免疫磁珠富集单核细胞增生李斯特氏菌,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增进行快速检测。所制备的免疫磁珠选取在37℃条件下均匀振荡1 h为最佳包被条件,1 mg磁珠偶联抗体的最佳量为100μg/mg,制备的免疫磁珠捕获率为45%。所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术在样品细菌浓度达到104 CFU/m L即可被检出,其灵敏度是直接PCR检测限(105 CFU/m L)的10倍,可为病原菌的富集和快速检测提供新方法。     

免疫磁珠分离技术在病原微生物检测中的应用

本文综述了免疫磁珠分离技术的基本原理、主要影响因素及其在病原微生物检测领域中的应用,重点介绍了该技术与传统的分离培养技术、PCR技术、免疫学技术联合使用后,可以更有效地分离各种标本中的病原体,提高实验室对致病微生物的检出率,缩短检测时间,为病原体检测提供了一种新的技术路线.     

食源性致病菌免疫学检测方法研究进展

食源性致病菌广泛存在,因其能引起人的疾病甚至死亡,而越来越受世界各国的关注。食源性致病菌传统检测方法为培养法,其费时耗力,不适用于快速检测。本文介绍的免疫学方法具有方便、快速等优点,因而越来越被广泛应用。免疫学检测方法主要有酶联免疫吸附法、免疫层析法、免疫磁珠分离技术、化学发光免疫分析法和乳胶凝集法等。本文着重对这些方法的原理及其应用进行综述,阐述其优缺点,同时对免疫学检测方法未来的发展趋势进行了展望。