骆驼凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达

骆驼凝乳酶具有独特的凝乳特性,在干酪加工制作中具有潜在应用前景。为获得高活性的骆驼凝乳酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母GG799为宿主,首次对经密码子优化的骆驼凝乳酶原(c PC)基因进行表达。将人工合成cPC基因插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1,构建重组载体pKLAC1-c PC,并用电脉冲法将SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,全细胞PCR鉴定,最后获得一株多拷贝整合的基因工程菌cPC 1。该菌株可分泌表达cPC,经SDS-PAGE分析,重组cPC的分子质量约为41 ku,符合预期;酸化处理后cPC的分子质量约为36 ku,可正确自我剪切。摇瓶发酵培养120h,酶活最高达230 SU/m L。分别以牛乳、骆驼乳和牦牛乳作为底物检测酶活性,结果重组骆驼凝乳酶对3种动物乳均具有凝乳活性。     

人溶菌酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

人溶菌酶是一种天然广谱抑菌物质,在食品和医药工业有潜在应用前景。为获得高活性的人溶菌酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母表达系统,对经密码子优化的人溶菌酶基因(h LYZ)进行分泌表达。将人工合成h LYZ插入到乳酸克鲁维酵母表达载体p KLAC1,构建重组载体p KLAC1-h LYZ,并用电脉冲法将SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过全细胞PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌h LYZ1。工程菌可以分泌表达分子量约14 ku的目的蛋白质,与预期大小相符。摇瓶发酵培养128 h,酶活最高达到1430 U/mL。抗菌活性检测结果显示,重组人溶菌酶对溶壁微球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有较好的溶菌活性。本研究成功地在乳酸克鲁维酵母中表达了重组人溶菌酶,表达的蛋白具有较高的酶活性,试验结果为利用乳酸克鲁维酵母表达系统规模化生产重组人溶菌酶奠了基础。     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。     

β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达

为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5A~(loop/H321G))克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5A~(loop/H321G),并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5A~(loop/H321G))的转化子GG799/AuMan5A~(loop/H321G),其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5A~(loop/H321G)的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5A~(loop/H321G)所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5A~(loop/H321G)在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。     

小牛凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的表达及遗传稳定性研究

目的:构建小牛凝乳酶原乳酸克鲁维酵母分泌型表达载体,表达重组凝乳酶原.方法:通过PCR获得小牛凝乳酶原cDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pKLAC1 α结合因子分泌信号下游,得到重组载体pKLAC1-prochymosin.SacII线性化后氯化锂转化乳酸克鲁维酵母GG799,用含5mmol/L乙酰胺的YCB固体培养基筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因,利用特异性引物筛选多拷贝转化子.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析并检测凝乳酶的活力,通过检测阳性转化子产凝乳酶的活力考察其遗传稳定性.结果:经测序及PCR证实,凝乳酶原cDNA准确插入酵母表达载体pKLAC1中,转化后重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明凝乳酶的分子量约为36kD,酸处理后测得培养基中凝乳酶的酶活为83SU/ml,阳性转化子遗传稳定性好.结论:成功构建出酵母表达载体pKLAC1-prochymosin,在培养基中获得分泌的重组凝乳酶原,经过酸处理后凝乳酶原转化为有活性的凝乳酶.     

黑曲霉β-葡聚糖酶基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达及重组酶性质

以黑曲霉（Aspergillus niger）高耐热葡聚糖酶编码基因eglA6在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中的表达及重组酶性质为研究目的。利用乳酸克鲁维酵母表达系统,构建表达eglA6基因的重组菌K. Lactis GG799/pKLAC1-eglA6 SL105,重组菌摇瓶发酵酶活达到23.0 U/mL。重组酶AnEglA6K表观相对分子质量为5.6×10⁴,明显高于同一基因在巴斯德毕赤酵母中的表达产物。重组酶最适pH为5.0,最适温度为75 ℃,在80 ℃时酶活半衰期为65.0 min。以微晶纤维素为底物时重组酶比酶活约为0.5 U/mg。基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达产物与其在巴斯德毕赤酵母中的表达产物有明显差异,前者相对分子质量明显高于后者,热稳定性和结晶纤维素降解活性也高于后者。以乳酸克鲁维酵母为宿主表达eglA6基因获得的重组葡聚糖酶具有很高的耐热性,适合在饲料工业中应用。     

rDNA介导的乳酸克鲁维酵母整合型表达载体的构建及初步验证

构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证。以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K. lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS。载体经Sac Ⅱ线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K. lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR (RTQPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1～3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6%,达到(590±13.33) U/mL。在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59%。通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K. lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K. lactis的进一步分子改造提供参考。     

重组嗜热乳糖酶在毕赤酵母中的表达、纯化与活性分析

为获得耐高温的重组乳糖酶,PCR扩增激烈热球菌(Pyrococcus furious)乳糖酶基因、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/Lac并转化毕赤酵母X-33菌株。重组酵母转化子经甲醇诱导,重组嗜热乳糖酶实现了分泌表达并经蛋白印迹验证。纯化前上清液中乳糖酶总活力高达125 U/mL,经镍亲合纯化得重组酶,SDS-PAGE显示其纯度在95%以上,比活力1 800 U/mg,该酶最适温度在105℃左右且热稳定性好,具有很强的水解乳糖能力。     

乳酸克鲁维酵母超量表达葡萄糖氧化酶的研究

本研究应用具有超量分泌表达能力的乳酸克鲁维酵母(Kl SEL1基因突变型)、游离型载体p KDU7以及整合型表达载体p KLAC1,对具有5个氨基酸点突变的葡萄糖氧化酶(该突变酶的比活是野生型葡萄糖氧化酶的3.24倍)进行分泌表达。最终获得了一株可以超量分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株,其最大产量为70±7 k U/L。这是现今已报道的分泌表达葡萄糖氧化酶能力最高的乳酸克鲁维重组菌株,为食品安全级的葡萄糖氧化酶的生产和应用提供了新途径。     

洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1脂肪酶的异源表达

通过PCR扩增出洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1脂肪酶基因,将基因片段分别克隆到大肠杆菌、毕赤酵母和枯草杆菌的表达载体,转入表达菌株中。结果表明,重组脂肪酶在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,在毕赤酵母中未有表达,而在枯草杆菌中实现了胞外分泌表达,测得发酵上清液酶活为13.8 U/m L。对重组枯草杆菌发酵条件进行了摇瓶初步优化和3 L的反应器分批培养。当以TB为出发培养基,初始p H 6.5,温度为37℃时,在3 L的发酵罐上最终酶活达到34.5 U/m L,是野生菌表达量的4.2倍。