大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达

为使大豆锰超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase,MnSOD）在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的MnSOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒pNZ8149和经改造的质粒pNZS上,表达载体pNZ-SOD和分泌表达载体pNZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L. lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L. lactisNZ3900/pNZ-SOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和酶活性对比分析。结果显示：L. lactis NZ3900/pNZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍,是L. lactis NZ3900/pNZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L. lactis NZ3900/pNZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。     

L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325中的表达

本文研究了在m RNA转录水平上三种L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325不同生长阶段的表达情况。以16s r RNA作为内参基因,应用实时荧光定量PCR技术测定不同生长阶段的菌体中L-乳酸脱氢酶基因(ldh、ldh X和ldh B)表达的动态变化规律。该菌株的生长曲线呈S型,培养2~6 h为菌体的生长对数期,随后进入稳定期。生长曲线的测定表明该菌株生长力极其旺盛;16s r RNA、ldh、ldh X和ldh B基因的扩增效率曲线显示,内参基因与目的基因的扩增效率一致且接近100%,这说明利用相对荧光定量法能够较好的反应目的基因的表达量;ldh、ldh X和ldh B基因在菌体生长的3个时间点(6 h、9 h和12 h)都有一定量的表达,随着菌体的不断生长,基因表达的变化均呈现显著性上升趋势,且上升幅度不断增加,在12 h时基因表达量达到最大值。其中ldh基因在的表达量在菌体生长的3个时间点存在显著性差异,而ldh X、ldh B基因的表达量存在极显著差异。     

牛凝乳酶原基因在食品级乳酸乳球菌中的重组表达

将牛凝乳酶原基因连接pNZ8149载体,并转化乳酸乳球菌NZ3900,经乳酸链球菌素Nisin诱导,测得重组菌株胞内凝乳酶活力达到0.7 SU/mL,培养基中检测不到凝乳酶活力,实现了牛凝乳酶原基因在乳酸链球菌Nisin诱导基因表达系统（nisin controlled gene expression system,NICE）中活性表达。在此基础上,将分泌信号肽SPusp45连接于pNZ8149,构建了分泌型表达载体pNZ8149s,并实现牛凝乳酶原基因在NICE系统中分泌表达。当使用1 ng/mLNisin诱导5 h后,重组菌株胞内检测不到凝乳酶活力,培养基中凝乳酶活力为1.2 SU/mL,说明pNZ8149s能够促使凝乳酶原从乳酸乳球菌中分泌。该方法为重组牛凝乳酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案。     

乳酸乳球菌表达系统及其启动子的研究进展

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是工业应用中一种重要的模式菌株,具有非致病性、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。高效可控的启动子是实现外源蛋白高效表达的关键因素之一。根据诱导机制,启动子可分为组成型和诱导型。本文阐述了乳酸乳球菌表达系统及其启动子结构,总结了生物信息学预测启动子及筛选克隆新启动子的方法,并对乳酸乳球菌启动子未来的研究方向进行了展望,可为深入研究启动子的结构和功能并进一步在工业上生产外源蛋白提供参考。     

具有溶栓活性的重组乳酸乳球菌的构建

利用PCR方法从纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)基因组DNA中扩增纳豆激酶原基因,构建了纳豆激酶原基因的表达载体pFY002,转化Lactococcus lactis NZ9000,得到活性表达纳豆激酶的重组菌Lactococcus lactis NZ9000/pFY002。利用纤维蛋白平板法检测其溶栓活性,并对诱导剂乳链菌肽(NisinA)的浓度、温度、诱导时间对重组菌产酶的影响进行探究。     

重组抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性研究

为了优化抗冻蛋白SF-P的重组表达,利用乳酸链球菌素Nisin对已构建的重组乳酸乳球菌进行表达。通过对诱导时间、诱导pH、诱导温度和诱导剂Nisin浓度等诱导表达条件进行优化,利用SDS-PAGE和Western blot确定最佳的表达条件;通过比较冷冻胁迫前后菌体的生长状况、发酵活力和细胞内钠钾离子含量的变化,研究重组菌在冷冻胁迫作用下的生理功能特性。结果表明:优化后的最佳表达条件为pH 7.0,诱导剂Nisin浓度15ng/mL,温度25℃,诱导时间6h;SF-P2诱导重组菌株可以显著改善乳酸菌由于经受冷冻胁迫导致的对数生长延滞期和稳定生长延滞期的增加,表现出较强的酸化活力,并且可以有效降低冷冻胁迫过程对乳酸菌细胞膜通透性的影响,起到保护细胞生理功能的作用,表明SF-P2诱导重组菌具有显著的抗冷冻胁迫保护作用。     

乳源血管紧张素转移酶抑制肽在乳酸乳球菌中的表达

在乳酸乳球菌中表达乳源血管紧张素转移酶抑制肽。选取了4种不同的来源于牛酪蛋白的血管紧张素转移酶(ACE)抑制肽,为了确保能够在人体消化液作用下正常发挥它们的ACE抑制活性,4种短肽以串联多肽(TP)的形式进行表达,并在各短肽单体间引入了人体内主要消化酶的酶切位点。根据TP的氨基酸序列和乳酸乳球菌的偏爱密码子,人工合成TP基因。然后将TP基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因串联于载体pSEC-E7,从而构建了pSEC-TP:GFP质粒,实现了2种蛋白在乳酸乳球菌中的共表达。经电击转化,将该重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,获得重组菌株NZ9000(pSEC-TP:GFP)。用Nisin诱导TP:GFP蛋白表达。RT-PCR、激光共聚焦扫描显微镜和SDS-PAGE鉴定表达产物。RT-PCR结果表明,TP:GFP蛋白在RNA水平表达成功;SDS-PAGE表明目标产物是35 ku的条带。在乳酸乳球菌中实现了乳源血管紧张素转移酶抑制肽的表达。     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶的乳酸乳球菌表达

构建棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶食品级分泌表达载体并在乳酸乳球菌MG1363(L.lactis MG1363)中实现表达。通过PCR扩增L.lactis MG1363基因组中分泌信号肽Usp45、质粒pLEB590的乳链菌肽(Nisin)抗性基因NisI和质粒pPIC9k-Abgl的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶基因Abgl,PCR方法连接后获得片段Usp45-Abgl-NisI,将其克隆到质粒pMD19中,CaCl2法转化到E.coli DH5α,测序鉴定后将该片段连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e中并转化到E.coli XL1-Blue,得重组子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI。通过PCR方法敲除质粒pMG36e-Usp45-Abgl-NisI中红霉素抗性基因以构建食品级分泌载体pMG36N-Usp45-Abgl-NisI,将其电转到L.lactis MG1363中。转化子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI能将β-葡萄糖苷酶分泌到胞外使七叶苷平板显色,L.lactis MG1363/pMG36N-Usp45-Abgl-NisI能在20 IU/mL Nisin上生长,经RT-PCR验证β-葡萄糖苷酶在乳酸乳球菌中实现表达。表明分泌型表达载体构建成功,为其在乳酸乳球菌中实现食品级活性表达奠定基础。     

乳酸乳球菌乳酸亚种产丁二酮的优化研究

分别研究了10种不同因素对乳酸乳球菌乳酸亚种产生丁二酮含量的影响。实验结果表明,各因素产生丁二酮最高量的条件分别为:培养温度为37℃,凝乳后0h,后熟12h,培养基pH调节为5.6,培养基中添加柠檬酸的量为0.15%;培养基中添加Vc的量为0.01%,培养基中添加金属离子的量分别为Mg2+0.03%、Cu2+0.02%、Mn2+0%,培养基中添加甘氨酸的量为0.2%,培养基中添加碳水化合物的量分别为葡萄糖为0%、蔗糖为0%;随着基质浓度增加丁二酮产量也随之增加。     

缓冲策略在乳酸乳球菌发酵生产乳链菌肽中的应用研究

通过对乳链菌肽生产菌株Lactococcus lactis Z801发酵特性的研究,并使用缓冲策略改善发酵条件,使乳链菌肽单批发酵效价得到大幅度提高。发现用Tris缓冲液配制CM发酵培养基,并添加1.5%的CaCO3,初始pH7.5,30℃,振荡培养可以使乳链菌肽的发酵效价提高近2700IU/mL,而且发现添加CaCO3可以大大延缓发酵后期发酵液效价的快速下降。      

Expression of milk-derived angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptides in Lactococcus lactis

Angiotensin I-converting enzyme (ACE) plays a key role in the regulation of blood pressure. Currently, most single or tandem repeats of ACE-inhibitory (ACE-I) peptides have been expressed in Escherichia coli. However, in this study, a food-grade system was constructed using Lactococcus lactis (L. lactis) to simultaneously express four different milk-derived ACE-I peptides with antihypertensive activity. Mixed peptides (MPs) fused with green fluorescent protein (GFP) and eight histidines were synthesized. To ensure potent ACE inhibition by the MPs in human digestive juice, pepsin and trypsin cleavage sites were introduced among the four ACE-I peptides. The MP fusion gene was inserted into expression vector pSEC-E7 with nisin induction and expressed in L. lactis NZ9000, then purified by affinity chromatography. The transformants containing pSEC-MP:GFP were identified based on green fluorescence using Leica laser scanning confocal microscopy. The target proteins were detected by SDS-PAGE analysis and displayed obvious immunogenicity by western blot. After hydrolysis with digestive enzymes, the IC₅₀ of the MPs was 118.63 μM. These results suggested that multiple milk-derived ACE-I peptides with antihypertensive properties could be produced using a food-grade lactococcal expression system.     

甜味蛋白Brazzein在乳酸乳球菌的表面表达及鉴定

为了提高甜味蛋白Brazzein的产量及甜度,将第29位的天冬氨酸、第31位的组氨酸和第41位的谷氨酸突变为赖氨酸、丙氨酸、赖氨酸,然后结合乳酸乳球菌密码子偏嗜性,对甜味蛋白编码序列进行优化。将优化的Brazzein基因克隆入表面表达载体p NZ8112,构建甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDSPAGE、免疫印迹及免疫荧光等方法验证甜味蛋白Brazzein成功表达于乳酸乳球菌表面,这为甜味蛋白Brazzein的商品化开发奠定基础。     

Characterization of four new Lactococcus lactis bacteriophages isolated from dahi whey

Four lytic phages of Lactococcus lactis ssp. diacetylactis isolated from indigenous dahi whey were examined for their stability, growth characteristics and morphology. All these phages were partially inactivated by CHCl₃ , remained stable at 40°C and were partially inactivated at pH 3. There was a marked difference among these phages with respect to latent period, rise period and burst size. All phages belonged to Bradley's group B.     

L.LactisKLDS4.0325细菌素理化性质的研究

该研究以分离自新疆牧民家庭自制酸马奶中的乳酸乳球菌KLDS4.0325为研究对象,以双层平板法为检测方法,以抑菌圈直径为检测指标,以大肠杆菌为指示菌,对该菌株所产细菌素进行提取、纯化及理化特性分析,首先无细胞发酵上清液通过60%饱和度硫酸铵溶液盐析得到细菌素粗提液,然后细菌素粗提液通过SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析法得到纯化的细菌素样品,其比活力可达51.02 IU/mg,较优化前提高了约18倍,并通过tricine-SDS-PAGE蛋白电泳测定分子量约为3.4 ku;最后,对细菌素样品的生物学特性进行研究,通过温度、pH和各种酶的敏感性试验得出,细菌素样品热稳定性强,在pH 2~10的范围抑菌圈直径变化不大,有较高的稳定性,经蛋白酶处理后,抑菌活性消失,但经淀粉酶处理后仍能保持较高的稳定性,这也说明该细菌素是蛋白类物质。     

Subspecies-Specific Nested PCR Assay for Detection of Lactococcus lactis spp. lactis and spp. cremoris

A nested PCR-based assay composed of Lactococcus lactis species-specific primers for the nest 1 amplification and subspecies-specific primers for the nest 2 amplification was validated with the identified strains of L. lactis isolated from dairy and nondairy sources and positive and negative control strains. Forward and reverse primer set was designed for nest 1 amplification targeting the conserved housekeeping gene yueF encoding nonproteolytic protein from peptidase family M16 of L. lactis. Amplicons of 447 bp of yueF were subjected for nest 2 amplification producing amplicons of 372 bp. The designed outer primer set for nest 1 amplification was observed to be specific to L. lactis because the DNA from other bacteria could not be amplified and the inner primer set for nest 2 amplification was found to be specific for the detection of ssp. lactis and cremoris of L. lactis.