南极磷虾原肌球蛋白纯化鉴定、理化特性及模拟表位肽预测

对南极磷虾原肌球蛋白（tropomyosin,TM）进行提取纯化与质谱鉴定,并对其热稳定性、pH值稳定性及消化稳定性进行研究,同时利用生物信息学对其进行序列同源性分析、空间结构同源建模及过敏原模拟表位肽识别。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,经蛋白粗提、热除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多步提纯,最终仅在32 kDa附近得到一条清晰条带。利用超高效液相色谱-质谱联用对其进行扫描,经UniProt数据库检索确定该目的蛋白为TM（Euphausia superba）,蛋白分子质量32.6 kDa,肽段覆盖率达97%。同源性分析结果表明南极磷虾TM是一种高度保守蛋白,与26 种甲壳动物的TM序列同源性在88%～98.2%之间。南极磷虾TM对热、酸碱及胃液消化均具有较强的稳定性,而对肠液消化稳定性较差,易被胰蛋白酶和糜蛋白酶降解生成低分子质量肽段。通过DNAStar Protean、AntheProt、BepiPred 1.0 server、ABCpred server、Immunomedicine Group 5 种生物信息学工具最终预测识别出8 条南极磷虾TM模拟表位肽（EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI）,并在其空间结构中进行一一映射。本研究为南极磷虾TM模拟表位肽的精准预测识别及其相关低致敏性产品的开发提供了科学依据。     

麻鸭脂肪氧合酶的分离纯化及其性质研究

采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶色谱等方法对麻鸭脂肪氧合酶(Shelduck Lipoxygenase)进行了纯化。结果显示,麻鸭LOX粗提液经60%⁸0%硫酸铵沉淀、DEAE离子交换层析、Superdex75凝胶过滤、SOURCE15Q离子交换层析后可达电泳纯,麻鸭LOX比活力为85714.3U/mg,纯化倍数98.64,经SDS PAGE分析麻鸭LOX的分子质量约为62 kDa。麻鸭LOX与大豆LOX的酶学性质差异较大,麻鸭LOX的最适温度为30℃,最适pH为6.0,且热稳定性和pH稳定性均优于大豆LOX。同时,Zn2+、Ca2+对麻鸭LOX的激活作用明显,而Mn2+对麻鸭LOX具有强烈的抑制作用。     

牛源二肽基肽酶-IV的高效制备及性质

以高效制备二肽基肽酶 IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV）为目的,以牛肾为原料,经酸沉淀、硫酸铵盐析和凝胶过滤层析获得高纯度DPP-IV。还原条件下,纯化蛋白的分子质量为106 kDa,纯化倍数为169.9,得率为9.5%。对该蛋白进行质谱鉴定得到12 个肽段,共517 个氨基酸残基,与牛DPP-IV氨基酸序列的匹配度为100%。对其性质研究发现,DPP-IV为糖蛋白且以二聚体形式（210 kDa）存在,等电点为5.8。DPP-IV的二级结构具有典型的β-折叠构象,热变性温度为（72.7±0.3）℃。金属离子Zn2＋、Fe2＋及Fe3＋对DPP-IV活力有明显的抑制作用,1 mmol/L的Zn2＋对DPP-IV力抑制率高达98%。     

鲈鱼脯氨酰内肽酶的分离纯化、性质分析及分子克隆

采用(NH4)2SO4盐析和连续柱层析法从鲈鱼（Lateolabrax japonicus）骨骼肌中分离纯化了一种脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase,PEP）。通过液相色谱-串联质谱分析,得到43 个与红鳍东方鲀的PEP高度一致的肽片段,证实该酶为PEP。以琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素为底物,确定PEP的最适pH 6.0和最适温度35 ℃。温度变化对PEP活力的影响较大,通过圆二色谱检测显示加热对PEP的二级结构有较为明显的影响,且热变性不可逆。通过分子克隆技术获得PEP全长cDNA开放阅读框含2 226 个核苷酸,编码741 个氨基酸残基,预测分子质量为84.12 kDa。通过同源建模得到鲈鱼PEP的分子结构,PEP为典型的α/β水解酶折叠排列,其催化三联体（His-711、Asp-672、Ser-585）被β-折叠形成的螺旋桨区域的中心通道所覆盖。催化活性中心空间构象稳定对维持PEP活力至关重要,而其独特的分子结构是底物特异性的基础。     

猪血管紧张素转换酶2的分离纯化及性质研究

血管紧张素转换酶2（Angiotensin converting enzyme 2,ACE2）是参与血压调节的关键酶之一,由于传统的ACE2纯化方法难度大、效率低,因此,有必要优化其分离纯化方法,为ACE2的基础研究提供保障。本研究以猪肾为原材料,通过酸沉淀、硫酸铵盐析,结合DEAE-Sepharose、Q-Sepharose及Phenyl Sepharose柱层析对ACE2进行分离纯化。探究了温度、pH、金属离子、抑制剂对纯化的ACE2的活性影响,并通过PAS染色验证其是否为糖蛋白。实验结果表明,纯化的ACE2分子量约为98 kDa,纯化倍数为149.8,得率为0.1%。对ACE进行质谱鉴定,得到41个肽段,与猪ACE2的氨基酸序列高度一致。酶学性质研究结果表明,ACE2为金属蛋白酶,最适pH为7.0,最适温度为40 ℃。Zn2+能激活其活性,而金属离子Cu2+、Fe3+和Cd2+对ACE2的活性有抑制作用。圆二色谱分析发现,ACE2的热变性温度为67.5 ℃。PAS染色结果显示猪ACE2为糖蛋白。本研究结果可为天然ACE2的高效纯化提供参考,也有助于推进以ACE2为靶点的功能性食品开发。     

Tween80诱导下米曲霉3．5232产胞内脂肪酶的研究

米曲霉3．5232在Tween80诱导下,相比于葡萄糖作为碳源的培养条件,米曲霉在细胞壁、细胞膜及细胞质中均可以诱导产生分子质量为27kDa的脂肪酶,而在细胞质中又有分子质量为36kDa的脂肪酶表达。利用硫酸铵沉淀,DEAE Sepahrose FastFlow离子色谱交换及SephadexG．75凝胶色谱的分离方法,从米曲霉细胞质中分离纯化了分子质量为36kDa的脂肪酶。最终纯化倍数为42．45,产率为0．12％。     

核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的分离纯化及稳定性研究

采用5种商业蛋白酶水解核桃粕，评估水解物对二肽基肽酶4（DPP-Ⅳ）的抑制活性，优选出碱性蛋白酶作为水解用酶。研究确定了碱性蛋白酶水解核桃粕的最佳水解时间为5 h,然后通过超滤和SP Sephadex C-25阳离子交换树脂柱层析分离纯化碱性蛋白酶水解物得到核桃蛋白DPP-IV抑制肽，并对所得DPP-IV抑制肽的热稳定性、pH稳定性和模拟胃肠道消化稳定性进行了测试。结果表明，核桃蛋白DPP-IV抑制肽（025 mg/mL）DPP-Ⅳ抑制率（76.19%）比未分离纯化的水解物的提高了约3倍，其富含碱性氨基酸（含量34.36%），尤其是精氨酸含量高达25.93%。核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽在高温（121 ℃）、极端pH（pH 1.0和pH 11.0）和模拟胃肠道消化条件下，均显示出良好的稳定性，因此可用作控制血糖的功能性食品成分。     

虾头、虾壳抗氧化肽的分离纯化及其对秀丽隐杆线虫的抗氧化作用

采用超滤、凝胶过滤色谱和制备液相色谱对南美白对虾虾头、虾壳蛋白质的酶解液进行分离纯化,以1,1-二苯基-2-苦基肼自由基清除率、还原力、氧化自由基吸收能力为指标,制备纯度较高、抗氧化活性较强的抗氧化肽,同时,采用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）模型对其体内抗氧化活性进行评价。结果表明：酶解液经超滤分离后,分子质量为3～10?kDa组分的抗氧化活性最强;将该组分采用凝胶过滤色谱、制备液相色谱等手段分离出含有抗氧化肽的混合物（抗氧化肽纯度达到70%）。体内抗氧化活性结果显示,喂食该抗氧化肽的秀丽隐杆线虫的产卵量和热应激条件下的存活率均显著增长,寿命显著延长（P＜0.05）,且与VC相比效果无显著差异（P＞0.05）,说明本研究所获得的抗氧化肽对秀丽隐杆线虫具有和VC相当的抗氧化保护作用,具有潜在的应用价值。     

体外消化对金瓜籽抗氧化肽抗氧化活性的影响

本实验以金瓜籽为原料,以还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率为考察指标,采用响应面试验探讨了制备金瓜籽抗氧化肽的工艺参数,并研究了其经体外模拟人体胃肠道消化后的游离氨基酸组成、分子质量分布及抗氧化活性变化。结果表明：制备金瓜籽抗氧化肽的最优工艺条件为底物（金瓜籽粕）质量分数为6%、添加碱性蛋白酶3%、在pH?8.5的体系中55?℃酶解90?min,此条件下所得羟自由基清除率、DPPH自由基清除率、还原力分别为（58.19±0.80）%、（60.27±1.73）%和0.49±0.01;分子质量小于3?kDa、3～5?kDa及大于5?kDa的抗氧化肽经体外模拟胃肠道消化后分别含游离氨基酸41.72%、36.94%和33.93%,其主要为分子质量小于500?Da的肽段,占比分别为73.50%、60.15%和53.30%;与消化前相比,消化产物对羟自由基的清除能力分别提高了26.04%、29.06%和34.43%,还原力分别提高了50.98%、64.53%、67.35%。该研究可为金瓜籽抗氧化肽作为功能性抗氧化剂的生产和应用提供参考。     

乌鸡低聚肽铁配合物的稳定性研究

以乌鸡为原料制备乌鸡低聚肽铁配合物,以分子量分布和铁含量为指标,对乌鸡低聚肽铁配合物的热稳定性、酸碱稳定性和消化稳定性进行了考察。结果表明:在温度为20⁸0℃时,乌鸡低聚肽铁配合物各个分子量区间的比例变化不超过2%,配合物的铁含量无显著性差异;在pH为380℃时,乌鸡低聚肽铁配合物各个分子量区间的比例变化不超过2%,配合物的铁含量无显著性差异;在pH为3⁹时,分子质量小于1 000 u的总含量略有升高,但升高不到6%,铁含量有所降低,但在广泛的pH范围内仍然有58.4%以上的铁含量;乌鸡低聚肽铁配合物经过蛋白酶消化后,分子质量小于1 000 u的总含量略有升高,但升高不到8%,经过胃蛋白酶消化和胰蛋白酶共同消化后,仍然有37.6%的铁含量。这说明乌鸡低聚肽铁配合物具有一定的热稳定性、pH稳定性以及消化稳定性。     

蓝圆鲹骨骼肌脯氨酸内肽酶的分离纯化及其对胶原肽的作用

以蓝圆鲹为研究对象,探讨脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP)对鱼类肌肉胶原蛋白的作用及其机理。通过硫酸铵分级盐析,DEAE-Sephacel阴离子交换,Phenyl-Sepharose疏水层析和Q-Sepharose阴离子交换,从蓝圆鲹骨骼肌中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS-PAGE结果显示,PEP的分子量为82 ku,肽质量指纹图谱分析得到16个肽片段,共169个氨基酸残基。片段序列与墨西哥鲷鱼(Neolamprologus brichardi)PEP的同源性达98.8%,证明纯化得到的酶是PEP。PEP的最适温度为35℃,但热稳定性较差;最适p H为6.0,在p H 5.0~7.5之间有较好的稳定性。将PEP与合成的鱼胶原蛋白小肽反应,利用反相高效液相色谱对产物进行分离,电喷雾质谱分析结果显示PEP的水解位点在脯氨酸残基的羧基端。以上结果表明,鱼类肌肉中的PEP能够协同金属蛋白酶,通过切割脯氨酸残基进一步降解胶原小肽从而参与到鱼肌肉胶原蛋白的新陈代谢中,是鱼死后参与胶原蛋白降解的重要酶类。     

大豆蛋白纤维聚集体的体外消化特性研究

本研究以大豆分离蛋白为材料,通过在pH 2.0条件下调控大豆蛋白形成大豆蛋白纤维聚集体。采用标准的静态体外消化模型INFOGEST 2.0对大豆蛋白纤维聚集体进行体外模拟消化实验,并对不同消化时间的胃肠消化产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、动态激光散射仪（DLS）及液相色谱-质谱联用（LC-MS）对其分子质量、粒径及肽段组成进行鉴定。结果表明,大豆蛋白纤维聚集体通过消化后被水解为小分子的肽,并LC-MS证实消化过程中肽段数量随着消化时间的增加呈阶梯式水解。本实验探究了大豆蛋白在体外模拟消化过程中的消化特性,这将有助于更好地了解植物蛋白在人体中的消化方式及其对健康的影响。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF（Q-Sepharose FF）离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水层析和丁基-琼脂糖凝胶HP（Butyl-Sepharose HP）疏水层析对黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子质量,并对其酶学性质进行研究。结果表明,经分离纯化后得到分子质量约为116 kDa的β-葡萄糖苷酶,纯化倍数达到50.39倍,回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg,该β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH值为5.0,在温度30～50 ℃,pH 2.0～8.0之间具有较好的稳定性。     

凡纳滨对虾组织蛋白酶L性质分析及其对肌肉蛋白的降解

本研究从凡纳滨对虾肝胰腺中纯化获得一种组织蛋白酶L,其分子质量约为31 k D,肽质量指纹图谱分析得到8个片段共112个氨基酸残基,与报道的凡纳滨对虾组织蛋白酶L序列完全一致。该酶的最适温度和最适pH值分别为35℃和5.5,且在0~40℃以及pH 5.5~6.5之间酶活力稳定。该酶仅对底物Z-Phe-Arg-MCA特异分解。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和Leupeptin对其有明显的抑制作用,而金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸对其有少量的激活作用。扫描电子显微镜观察结果显示,随着低温贮藏时间的延长,对虾肌肉纤维的断裂程度不断增加。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,组织蛋白酶L可使肌肉蛋白发生分解,推测其可能参与对虾低温贮藏过程中肌肉的降解。     

硫酸软骨素螯合锌的制备、表征及体外生物活性

本研究利用正交试验优化硫酸软骨素螯合锌制备工艺条件。选用硫酸软骨素与硫酸锌为原料,以锌螯合率为指标,通过单因素实验及正交试验考察pH、反应时间、硫酸软骨素与七水合硫酸锌质量比、反应温度对锌螯合率的影响。采用紫外光谱分析、傅里叶红外光谱分析、扫描电镜分析、热重分析、X射线衍射分析等方法对硫酸软骨素螯合锌进行结构表征。利用体外模拟胃肠消化吸收方法测定硫酸软骨素螯合锌中锌离子的生物利用率。结果表明:硫酸软骨素螯合锌的最佳制备工艺条件为pH4,反应时间1 h,硫酸软骨素与七水合硫酸锌质量比1:1,反应温度30 ℃,此条件下锌螯合率为（80.6%±1.31%）。紫外光谱分析结合红外光谱分析显示,锌离子与硫酸软骨素的羟基、羧基、磺酸基结合,形成硫酸软骨素螯合锌螯合物;扫描电镜分析及X射线衍射分析表明硫酸软骨素螯合锌的微观形貌为具有晶体结构的微颗粒;热重分析证明硫酸软骨素螯合锌的热稳定性优于硫酸软骨素。体外模拟消化吸收分析结果表明:硫酸软骨素螯合锌中锌离子在胃肠道中的溶解率与透过率均高于无机锌盐,硫酸软骨素螯合锌具有更好的生物利用率。该研究结果可为开发新型补锌剂提供研究思路和理论依据。     

不同分子量红花籽抗氧化肽稳定性研究

目的:研究不同分子量红花籽蛋白抗氧化肽活性的稳定性。方法:以脱壳红花籽粕为实验材料,经复合酶酶解分离制备抗氧化肽,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH）自由基、超氧阴离子自由基（superoxide anion radical,O₂?·）及羟自由基（hydroxyl free radicals,·OH）清除能力为指标,探讨温度、pH、食品原辅料、金属离子及模拟胃肠消化等环境因素对不同分子量红花籽抗氧化肽活性的影响。结果:红花籽蛋白酶解物<3 kDa（SSPH-Ⅰ）、3~5 kDa（SSPH-Ⅱ）较分离前活性显著增加（P<0.05）,SSPH-Ⅲ（5~10 kDa）和SSPH-Ⅳ（>10 kDa）较分离前活性显著降低（P<0.05）,选取活性显著增加组分研究发现SSPH-Ⅰ抗氧化活性更加稳定,能在60~121 ℃高温、pH6~8弱酸弱碱条件下保持活性,各自由基清除率维持率达到90%以上,10 g/100 mL NaCl和葡萄糖、0.2 g/100 mL柠檬酸对SSPH-Ⅰ抗氧化活性有增强协同作用,各自由基清除率维持率增加至105%左右,10 g/100 mL的蔗糖和0.2 g/100 mL的防腐剂对活性影响不大,添加Cu2+、Zn2+和K+金属离子对SSPH-Ⅰ抗氧化稳定性显著下降（P<0.05）,其影响顺序为:Cu2+>Zn2+>K+>Mg2+>Ca2+,经模拟胃肠消化后活性较稳定,维持率为80%。结论:筛选得到<3 kDa红花籽蛋白抗氧化肽组分活性较高且稳定,为其工业化生产及应用提供理论依据。     

纳豆芽孢杆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析

以菜用大豆为原料，直投式纳豆芽孢杆菌作为发酵剂，纳豆激酶活力作为评价指标，通过单因素和正交试验优化纳豆激酶发酵工艺条件；通过盐溶、硫酸铵分段盐析、二乙氨乙基（DEAE）阴离子交换柱分离纯化纳豆激酶，并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定其分子质量，并进行酶学性质和体外溶栓效果分析。结果表明，菜用大豆发酵生产纳豆激酶的最佳条件为：每100 g蒸煮菜用大豆接入1.15×1011 CFU/g直投发酵剂，发酵温度37 ℃、发酵时间36 h、后熟时间18 h时，此时纳豆激酶活力可达2 326.60 IU/g。纳豆激酶的分子质量介于25～35 kDa之间，最适作用温度、pH值分别为37 ℃、8.0，当温度低于40 ℃、pH值在6.0～8.0时较稳定；体外溶栓实验表明纳豆激酶具有良好的体外溶栓效果。     

酶解法制备条浒苔抗氧化肽工艺优化及其消化稳定性研究

本研究旨在优化中性蛋白酶水解条浒苔蛋白制备抗氧化肽的工艺条件,并对水解物的消化稳定性进行表征。以DPPH自由基清除率和水解度(DH)为指标,在单因素实验的基础上采用响应面分析法优化条浒苔抗氧化肽的制备工艺。通过三级膜分离系统将酶解物分离成不同相对分子质量的三个组分,采用体外模拟消化试验测试不同相对分子质量范围组分的消化稳定性。结果表明最佳酶解条件为:温度47℃、pH7.4、加酶量3300 U/g pro、时间3.3 h、固液比1:20 g/mL,在此条件下酶解物的DPPH清除率为84.33%±1.78%,模型预测值为85.53%,经检验,实测值与预测值无显著差异(P=0.444),模型可靠;相对分子质量小于10 kDa的两个组分具有较强的抗氧化活性和消化稳定性,大于10 kDa的组分抗氧化活性明显较低,经过消化酶消化后抗氧化性显著下降。条浒苔蛋白质经中性蛋白酶水解后可获得具有抗氧化活性和消化稳定性的蛋白肽,工艺模型可靠,水解物在食品中具有潜在应用价值。