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1.
目的建立实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测大肠埃希氏菌O157的分析方法。方法根据大肠埃希氏菌O157的rfbE基因(S83460.1),设计特异性引物和exo探针,分别进行引物探针筛选和特异性、灵敏度以及稳定性探究,并对人工污染样品和实际样品进行检测,验证本研究方法的实用性。结果本方法在37℃恒温20 min内可完成对大肠埃希氏菌O157的定性检测,目的 DNA的检测限为0.01ng/μL,目的菌的检测限为10~3CFU/mL。在稳定性实验中,选择从100~0.001 ng/μL的10倍梯度稀释的目的 DNA进行每个浓度8个平行的测试, 0.01 ng/μL及以上浓度的DNA的8个平行均可稳定检出。对于大肠埃希氏菌O157的初始污染量为4 CFU/25 g的牛奶和鸡肉人工污染样品,增菌9 h后,可检出其中的目的菌。用本方法和国标方法 GB 4789.36-2016同时检测20份实际样品,结果一致。结论该方法快速、简便,可作为一种常温下大肠埃希氏菌O157的快速检测手段,应用于基层实验室或现场检测。 相似文献
2.
目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针, 合成基因片段绘制标准曲线, 在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后, 对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%; 基因组DNA检测敏感性为7.11×102 fg/μL; 纯培养物水平检测敏感性为1.0×102 CFU/mL; 重复性变异系数在0.10%~1.00%之间; 标准曲线相关系数r2为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法, 该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短, 仅为35 min的特点, 可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。 相似文献
3.
采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),开发产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)的等温检测方法,结合圆盘式微流控芯片快速检测目标微生物.以stx1和stx2基因为靶点,设计和筛... 相似文献
4.
目的将水质检验的酶底物法用于食品检验,探索酶底物法是否能快速检测食品中的大肠埃希氏菌。方法测定食品样品,比较酶底物法与传统鉴定法结果的一致性。结果传统方法检出24份阳性和8份阴性,酶底物法检出25份阳性和7份阴性。实验结果进行X~2检验,结果无显著性差异(X~2=0.087,P0.05)。32份样品MPN值结果一致,8份样品MPN值有差异,其中7份样品酶底物法的MPN值大于传统法。结论酶底物法可用于食品中大肠埃希氏菌的快速检测,具有快捷简便、特异性高的优势。 相似文献
5.
目的研制植物源性成分绿豆基质中O157和O111检测能力验证样品,建立有效的样品制备流程来考核实验室检测致泻大肠埃希氏菌O157和O111的能力,根据参加实验室检测结果是否准确及可靠来评价实验室检测水平,并促进实验室检测体系进一步完善。方法选用O157和O111的ATCC标准菌株制备样品,以绿豆粉为基质,真空冷冻干燥技术制备样品。采用显色培养基、荧光定量PCR、全自动细菌生化鉴定仪、VIDAS全自动免疫荧光分析仪和血清型鉴定进行定性检测,并进行菌落计数。结果随机选取每一批阳性样品中的30个样品,每个样品中目标菌数在21~60 CFU之间,并且A组与B组阳性样品中均检测出目标菌,而阴性样品中均没有出现目标菌。结论表明采用本方法制备的能力验证样品均一稳定,能较好地评价实验室致泻大肠埃希氏菌O157和O111的检测能力。 相似文献
6.
首先通过免疫磁技术实现目标菌的有效富集,然后经同时标记了大量抗体与β-内酰胺酶的胶体金纳米探针介导,利用β-内酰胺酶高效水解青霉素实现检测信号转导及放大,再通过免疫层析法对青霉素含量变化的灵敏甄别,最终实现大肠埃希氏菌O157:H7的超灵敏检测.建立的检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7的检测灵敏度为2×102?CFU... 相似文献
7.
建立快速、灵敏的多重重组酶介导等温扩增方法(recombinase aided amplification,RAA)同时检测食品中的大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。方法 根据大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因、沙门氏菌的invA基因以及金黄色葡萄球菌的nuc基因的序列保守区域设计RAA特异性引物,筛选出最优的引物组合并优化各项实验条件;通过标准菌株验证方法特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,验证方法在实际食品样本中的检测能力。结果 多重RAA方法最佳扩增温度为37℃,反应时间为50 min;方法特异性良好,仅对目标菌株存在特异性扩增条带,与其他常见食源性致病菌无交叉反应;方法对基因组DNA的检测灵敏度为0.10 ng/μL;方法对经过简单增菌的人工污染牛奶样本和牛肉干样本中目标菌株的检出限为100 CFU/mL。结论 本研究建立的多重RAA扩增方法具有特异性好、灵敏度高、检测通量高等优势,适用于多种场景下食品样本中3种食源性致病菌的快速检测。 相似文献
8.
比较mini-VIDAS、膜芯片两种快速筛检方法和常规培养法,以确定两种快速筛检方法对大肠埃希氏菌O157:H7筛检的效果。以大肠埃希氏菌O157:H7为目标菌,针对3种方法设计灵敏性、特异性、抗干扰性试验和人工污染试验。结果表明,常规培养法和mini-VIDAS法的灵敏性较高,mini-VIDAS法和膜芯片法的特异性和抗干扰性较高,人工污染试验三者表现符合预期。日常检验中可采用国标法和mini-VIDAS法进行筛检工作,应急检验可使用膜芯片法缩短筛检时间,mini-VIDAS法和膜芯片法可作为初步筛检的工具使用。 相似文献
9.
针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参(internal amplification control,IAC),建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应(polymeasechain reaction,PCR)检测方法。结果表明,该方法对E. coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/mL;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999)。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止“假阴性”的发生。 相似文献
10.
产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一种重要的引起人畜共患病的致病菌,能引起水样便及酸中毒,建立快速、准确的检测方法对预防和控制产肠毒素大肠埃希氏菌的感染具有重要意义。基于ETEC不耐热肠毒素LT基因序列,设计LAMP引物检测产肠毒素大肠埃希氏菌。结果表明:LAMP检测产肠毒素大肠埃希氏菌的检出限为32.9cfu/mL,人工污染生猪肉的检出限为55cfu/g。LAMP将可以成为替代PCR的核酸扩增新技术,为快速检测产肠毒素大肠埃希氏菌构建了一个技术平台。 相似文献
11.
建立了环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测食源大肠杆菌O157,并对该方法的灵敏度和特异性进行了评价。分别针对大肠杆菌O157三个特异基因rfbE,stx1和stx2的8个独立靶区域设计了外引物、内引物和环引物进行LAMP扩增检测,同时将检测结果与PCR方法做比较。研究结果表明,rfbE,stx1和stx2基因的LAMP方法检测限分别为100,100和10 fg DNA/管,灵敏度是PCR方法的10倍以上;将建立的环介导等温扩增法用于417株食物分离的大肠杆菌的检测,发现LAMP检测rfbE,stx1和stx2基因的灵敏度分别为100%,95.3%和96.3%,对3个靶基因的阴性预测率分别为100%,96.7%和97.1%,特异性和阳性预测率均为100%。结果表明,该方法用于大肠杆菌O157的检测具有特异性强、灵敏度高、操作简便的优越性,在食品安全检测方面具有良好的实际应用前景。 相似文献
12.
Tests for Escherichia coli and E. coli O157 were carried out on meat samples collected from randomly chosen stores throughout the city of Bologna and suburban areas. The samples consisted of 25 g of loose minced beef, sometimes already shaped into meatballs or hamburgers, some of which were mixed with vegetables. The meat was purchased from retail outlets, open market stalls, and supermarket chains during 25 sampling visits from October 2000 to December 2001. For E. coli detection, Tryptone soya broth (TSB) supplemented with novobiocin and C-EC agar were used. Immunomagnetic separation with SMAC-BCIG-CT agar and chromogenic E. coli O 157 agar, API 20E system and agglutination latex test were used to detect E. coli O157; Vero cell assay and polymerase chain reaction (PCR) were used to assess toxin production and the presence of virulence genes. E. coli were detected in 45 (30.2%) of the 149 samples examined, mainly in the hamburger samples mixed with vegetables and in the loose minced beef. E. coli O157 was found in one sample of hamburger and two samples of hamburger mixed with vegetables (2%) collected from three different butcher's stores between July and October. All the strains of E. coli O157 and most cases of E. coli were found in meat from small retailers. The three strains of E. coli O157 were positive for verocytotoxin production. PCR analysis revealed genes coding for vt2 and one strain possessed the gene for eae A. Chromogenic E. coli O157 agar was found to be more selective and differential, allowing easier identification of suspected colonies with mixed flora and producing less false-positive colonies. 相似文献
13.
大肠杆菌O15 7:H7是一种感染剂量小 (10个活菌 ) ,危害性很大的致病菌。近年 ,在世界各地屡次发生大肠杆菌O15 7:H7的感染事件。因此 ,在食品卫生和安全领域 ,对大肠杆菌O15 7:H7致病机理、生物学特性、检测方法、预防和控制已成为研究热点。作者对大肠杆菌O15 7:H7的致病性、生化特性、检测方法及其在食品中出现的情况作了系统的介绍 相似文献
14.
Numbers of cases of human infections caused by Escherichia coli O157 have increased over the last decade in many countries. As well as the typical symptoms of gastrointestinal illness, the organism can cause more life-threatening diseases such as haemorrhagic colitis and haemolytic uraemic syndrome (HUS). Although the incidence remains relatively low compared with the other foodborne pathogens such as Campylobacter and Salmonella, the mortality rate associated with infection is much higher. Cattle are thought to be the main environmental source of this organism, and most cases have been associated with consumption of beef and beef products. However, other food vehicles have been identified, such as apple cider and raw or unpasteurised milk and milk products. Cross-contamination has been shown to be an important factor in outbreaks, which, together with the fact that the infectious dose is low (as few as 10 cells), means that robust hygienic procedures are essential at all stages of the food chain to reduce risk of infection. Person-to-person spread is a common source of illness, and several laboratory-acquired cases have also occurred. Efficient detection, isolation and confirmation techniques are required to establish the reservoirs of this organism in the environment and its spread into, and within, the food chain. This article reviews the epidemiology of E coli O157 and discusses detection and preventative methods, both developed and developing. © 1999 Society of Chemical Industry 相似文献
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重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合,以代替传统PCR热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术。本研究基于RPA技术建立了转基因水稻Cry1Ab/c基因的检测方法,可在37℃恒温条件下快速检测到转基因水稻中的Cry1Ab/c基因,具有较好的特异性,其绝对及相对检测灵敏度分别达到100个拷贝和0.1%(质量分数),适用于基层实验室及现场快速检测转Cry1Ab/c基因水稻及其制品。 相似文献
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对武汉市售蔬菜(50份)进行大肠杆菌O157的检验,经过新生霉素-EC增菌液增菌、免疫磁珠富集、选择性平板培养和血清学鉴定,从一份生菜中筛出1株O157阳性菌株EC9.23。PCR鉴定该菌毒力基因,stx1、stx2、rfbO157基因均为阳性,hly、eae、fliCH7基因均为阴性。说明从武汉市售蔬菜中可检出携带志贺毒素基因的O157菌株。 相似文献
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目的:研制一种能够同时快速检测大肠埃希O157:H7、志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌的三重PCR试剂盒.方法:以大肠埃希O157:H7的hlyAB基因、痢疾志贺氏菌的IpaH基因和致病性蜡样芽孢杆菌的hblA基因作为目的基因片段O157:H7、痢疾志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌的特异性抗原基因序列,分别设计1对引物,并对其反应条件进行优化,建立1种多重PCR检测试剂盒.结果:本试剂盒可准确检测出生肉和即食肉制品中的上述3种致病菌,O157:H7检出极限为19.8 cfu/mL,志贺氏菌检出极限为17 cfu/mL,蜡样芽孢杆菌检出极限为17.7 cfu/mL.可在5 h内完成全部反应过程,得出检测结果.结论:本试剂盒在理论和实际应用方面均具有优越性,能够同时检测上述3种病原菌,可用于食品及其原料的生物安全检测,也可用于兽医临床诊断. 相似文献
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大肠杆菌O157:H7是目前国内外极为关注的食源性致病菌,快速检测大肠杆菌O157:H7显得尤为重要.特针对9大类食品分别进行了传统培养法和3M TecraTM微孔板法的对比实验,并选择了其它血清型大肠杆菌和其他种属细菌进行了特异性的检验.在199份阳性样品中, 3M TecraTM大肠杆菌O157微孔板法的检出率为100%,传统培养法则为97.5%,3M TecraTM大肠杆菌O157微孔板法的灵敏度达到1 CFU/25g(mL),且该方法具有快速、简便、高效、准确的特点,适宜大规模化食品样品大肠杆菌O157检测. 相似文献
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Five strains of Escherichia coli O157:H7 with ATCC 11775 E. coli were grown in brain heart infusion (BHI) broth (pH 5.8, adjusted with citric acid) and treated with butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hy-droxytoluene (BHT), tertiary butylhydroquinone (TBHQ), and propyl gallate (PG) individually or combined. Additives ranged from 100–400 ppm with inocula levels between 5 and 104 CFU/mL in tissue culture plates or in flasks; samples were incubated at 4°C or 37°C for 24 hr. Additive antimicrobial efficacy varied with inoculum level and incubation temperature. BHA at <200 ppm was bactericidal on all strains. Poly-hydroxyl additives (TBHQ, PG) were less effective at 4°C. BHA-BHT combinations were synergistic at 4°C. 相似文献
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