应用LAMP检测方法检测肉制品中的单增李斯特菌

本研究使用恒温环介导技术, 以单增李斯特菌的肌动蛋白大会诱导蛋白聚集因子A(actA)基因设计引物, 建立单增李斯特菌的LAMP快速检测方法.不同来源的13株单增李斯特菌LAMP检测均显示阳性, 其他21种细菌LAMP检测显示阴性.使用使用本研究建立的LAMP方法检测肉类样品中的单增李斯特菌结果与细菌分离方法检测结果一致.     

基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

目的：建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法：针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果：所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^-1,且与其他菌株核酸无交叉反应。结论：成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测食品中的单增李斯特氏菌

采用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测食品中的单增李斯特氏菌,并做特异性、敏感性和适用性试验。试验结果显示以单增李斯特氏菌hly基因保守区设计特异性引物,进行DNA等温扩增是可行的。3株单增李斯特氏菌均扩增出特异性目的片段,而10株非单增李斯特氏菌均未产生目的片段。用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达100cfu/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测50种样品中的单增李斯特氏菌,结果数据显示两种方法的符合率达100%,表明环介导等温扩增法具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌

该研究针对单增李斯特氏菌的特异性基因hlyA设计引物,优化反应条件,建立实时荧光环介导等温扩增（realtime loop-mediated isothermal amplification,real-time LAMP）的检测方法,在此基础上,建立检测单增李斯特氏菌的基于淬灭基团释放环介导等温扩增检测方法（detection of amplification by release of quenching-LAMP,DARQ-LAMP）,分析其特异性和灵敏度。结果表明,该方法的适宜反应条件为反应温度63℃、Bst DNA 3.0聚合酶0.32 U/μL、淬灭探针双链（quenching probe double chain,QPD）探针浓度10%、Mg2+浓度6 mmol/L;对单增李斯特菌的检测限为7.3×101copies/mL,灵敏度是普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的100倍。该方法效率高、特异性好、灵敏度高,为环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究提供参考。     

单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立

本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的指示剂,在不开盖进行凝胶电泳检测的情况下,可直接根据体系颜色变化判读结果,能够在20 h内(包括增菌时间)检测出样本中是否存在单增李斯特菌的RNA。本研究建立的RT-LAMP-HNB检测方法对单增李斯特菌RNA的检出限为5.8×10~(-3)μg/m L,起始接种浓度检出限为10 CFU/10 mL,灵敏度是RT-PCR的10倍,且能够检测出是牛奶中否存在的单增李斯特活菌,具有实际应用价值。本研究开发的检测方法具有快速、准确、便捷、灵敏度高等特点,适用于在基层或不便利地区推广使用。     

单核细胞增生李斯特氏菌LAMP试剂盒的研制及在食品检测中的应用

利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立食品中单增李斯特氏菌的检测方法。通过对反应条件的优化,组装单增李斯特氏菌LAMP检测试剂盒,并对其特异性、敏感性和适用性进行验证。试验结果显示:该试剂盒适用于食品中单增李斯特氏菌的快速检测,用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达17CFU/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测120种样品中的单增李斯特氏菌,两种方法的符合率达100%。该试剂盒具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

食品中单增李斯特菌环介导等温扩增检测技术

目的：建立一种快速、简单地检测食品中单增李斯特菌的环介导恒温基因扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并初步建立荧光定量LAMP检测单增李斯特菌的方法。方法：根据LAMP方法的原理,设计LAMP检测引物,建立LAMP检测方法,同时对方法的特异性、灵敏度、重复性及初始拷贝数的对数值与反应时间之间的线性关系进行评估。结果：使用LAMP引物可以在0.5h内完成检测工作;LAMP检测技术的灵敏度高出聚合酶链式反应检测技术100倍以上,检出限达到1.72×101拷贝/反应,与其他食源性致病菌无交叉反应,平均实验间变异系数小于5%;反应时间与初始模板浓度的常用对数值有良好的线性关系(R2=0.9994)。结论：本方法具有快速、灵敏、特异、操作简单、设备要求低的特点,具有广阔的应用前景。     

PMA-LAMP检测单增李斯特活菌方法的建立

建立一种将荧光染料Propidium Monoazide（PMA）与环介导等温扩增（LAMP）相结合的检测方法,用于高效检测活的单核细胞增多性李斯特氏菌（简称单增李斯特菌）。利用PMA抑制单增李斯特死菌后进行LAMP扩增实验、并研究了PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的灵敏度,同时与PMA-PCR方法灵敏度进行比较。结果表明,50μmol/L的PMA处理浓度为5×108cfu/mL单增李斯特死菌,能够完全抑制LAMP扩增。PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的检出限为4.9×101cfu/mL,其灵敏度是PMA-PCR方法的10倍。该方法可以作为一种快速检测单增李斯特活菌的新技术。      

PMA-LAMP检测单增李斯特活菌方法的建立

建立一种将荧光染料Propidium Monoazide(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的检测方法,用于高效检测活的单核细胞增多性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)。利用PMA抑制单增李斯特死菌后进行LAMP扩增实验、并研究了PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的灵敏度,同时与PMA-PCR方法灵敏度进行比较。结果表明,50μmol/L的PMA处理浓度为5×108cfu/mL单增李斯特死菌,能够完全抑制LAMP扩增。PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的检出限为4.9×101cfu/mL,其灵敏度是PMA-PCR方法的10倍。该方法可以作为一种快速检测单增李斯特活菌的新技术。     

Rapid detection of food-borne Listeria monocytogenes by real-time quantitative loop-mediated isothermal amplification

The purpose of this study was to develop a real-time quantitative loop-mediated isothermal amplication (LAMP) method for the rapid, sensitive, and convenient detection of Listeria monocytogenes in food. The LAMP method could amplify the hlyA gene of L. monocytogenes successfully at 63°C with a loopamp real-time turbidimeter. The detection limits of the LAMP for hlyA gene were 6 colony forming units (CFU)/tube. A standard curve was generated for L. monocytogenes LAMP by plotting the graph based different log CFU values of L. monocytogenes and time of positivity through real-time monitoring of the amplication. Then, the LAMP method was employed to test 94 retail food samples effectively. Sensitivity in detection of L. monocytogenes by the LAMP was higher than that of PCR and none of the conventional methodpositive samples was missed by the LAMP method.     

环介导等温扩增技术快速检测双歧杆菌属细菌

目的建立一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测双歧杆菌属细菌的方法。方法针对双歧杆菌属细菌16S rDNA基因特异性区段设计LAMP引物,根据反应体系的颜色或浊度变化特异性地检测样品中双歧杆菌属细菌。结果对5株双岐杆菌属细菌和19株非双歧杆菌属细菌进行特异性和非特异检测,结果均为100%。该检测可在60 min内完成,双歧杆菌属细菌DNA的检测限为16.1±8.2 pg/μL,对双歧杆菌属细菌菌体的检测限为0.1 CFU/mL。结论LAMP方法可作为传统国家标准检测方法的辅助手段,有效检测食品、保健食品和药品中双歧杆菌属细菌DNA的存在。     

环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法.根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较.结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌.     

环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法。根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较。结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌。      

环介导等温扩增技术快速检测食品过敏原牡蛎成分

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法快速检测食品中的过敏原牡蛎成分。方法根据国家生物技术信息中心的牡蛎线粒体序列,通过Primer Explorer version 5.0软件设计引物并筛选出LAMP特异性扩增引物。并进一步对反应体系优化,对该方法的灵敏度、特异性以及稳定性进行验证。对10种牡蛎阳性样品、14种阴性样品、4类牡蛎相关食品进行检测。结果该方法可以检测出含牡蛎成分0.1%, DNA浓度为0.01 ng/μL的样品。在实验时间上大幅缩短,反应可在25～45 min内结束,并且可以在微量体系下完成,对于食品相关产品的检出率为100%。结论该方法操作简单、成本较低、特异性高、灵敏度好,适用于食品中过敏原牡蛎成分的检测。     

Rapid detection of Listeria monocytogenes in raw milk with loop-mediated isothermal amplification and chemosensor

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) allows a rapid amplification of nucleic acids under isothermal conditions. It can be combined with a rhodamine-based dual chemosensor for much more efficient, field-friendly detection of Listeria monocytogenes. In this report, LAMP was performed at 63 °C for 10 min, followed by a rapid reaction of DNA amplification and the byproduct, pyrophosphate ion, with a rhodamine-based dual chemosensor and Cu(2+) is visualized as a disappearance of red color. The detection limit of L. monocytogenes by the LAMP-chemosensor was 8 to 10 cells per reaction tube, and the total assay time including 10 min for rapid DNA extraction was approximately 30 min. Data on naturally contaminated raw milk samples indicated that the LAMP method was highly specific and sensitive, giving 100% concordance with the ISO 10560 reference method. The results showed that the LAMP-chemosensor method has the advantages of better sensitivity and speed and less dependence on equipment than the standard Polymerase Chain Reaction for specifically detecting low levels of L. monocytogenes DNA, and this can be useful in the field as a routine diagnostic tool. PRACTICAL APPLICATION: The LAMP-chemosensor method reported here provided a powerful tool for detection of L. monocytogenes in raw milk samples due to its specificity, sensitivity, and rapidity.     

环介导等温扩增法快速检测食源性致病菌

目的考察环介导等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的应用效果。方法待检样品按照GB4789系列标准进行前增菌后,提取核酸进行致病菌检测。结果食品中6种常见的致病菌:金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌和大肠杆菌O157检测阳性符合率100%,阴性符合率100%,检出限介于3.0×10~3～1.1×10~4 CFU/25 g,前增菌时间最快5h,检测时间为2d。结论环介导等温扩增技术具有检出限低、特异性好、检测速度快等优点,能较好地满足进出口食品中致病菌快速检测的要求。     

反转录-环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌

建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等温条件下,RT-LAMP反应可在30 min内完成。在活菌/损伤菌模型中,该方法表现出比国标法更好的准确性。在23株细菌标准菌株中仅对4株志贺氏菌有特异性检出。志贺氏菌RNA模板的检测灵敏度为7 fg/μL。人工污染脱脂乳样品检测灵敏度达到40 CFU/g,比RT-PCR方法高出2个数量级。表明所建立的志贺氏菌RT-LAMP扩增方法可以准确的检测志贺氏菌,同时具有快速、特异、灵敏的优势,可用于志贺氏菌的快速筛查和现场监控。     

环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌

利用环介导等温扩增方法的快速、简便等优点,建立一种检测乳中阪崎肠杆菌的方法。以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因,设计特异性引物。优化并建立LAMP检测乳中阪崎肠杆菌的方法。结果表明,LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为3.7×101cfu/mL,其灵敏度是PCR方法的10倍。人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为4.3×101cfu/mL。对23株致病菌进行特异性实验,特异性良好。该方法具有特异性强、灵敏度高、设备简便、耗时短等优点,在食品检测中具有良好的应用前景。      

环介导等温扩增技术快速检测食品中的耐热芽孢菌

针对食品中的好热黄无氧芽孢菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等耐热芽孢菌,以spo0A基因部分序列为靶基因,设计了一套引物,能够同时对这3种菌进行环介导等温扩增(LAMP)检测,扩增只需要60min。该法快速并具有良好的特异性,灵敏度可达到8cfu/mL,是普通PCR的10倍。DNaseI的使用与LAMP结合,可有效降解死菌游离DNA,消除其影响。结果表明,该方法用于奶粉及罐头制品中耐热芽孢菌的检测,具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点,在食品微生物检测中拥有广阔的前景。