烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）SRAP-PCR 体系建立及优化

采用烟草靶斑病菌YC-9, LJT-8和QYS-7为DNA模板,初步筛选SRAP引物组合;采用L16(45)正交试验设计,对烟草靶斑病菌的SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs, Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板浓度等5个因素进行优化试验。结果表明:共筛出13对扩增条带清晰且多态性好的引物组合;烟草靶斑病菌的最佳SRAP反应体系为Mg2+浓度2.0 mmol/L、dNTP浓度200μmol/L、Taq DNA聚合酶0.8U、引物浓度140 mmol/L、模板DNA 20 ng及1×PCR buffer,反应总体积为20 μL;各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为Taq DNA聚合酶>引物> Mg2+> dNTPs=模板DNA。      

烟草抗PVYN突变株SN01的SRAP—PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验对烟草抗PVYN突变株SN01幼嫩叶片的SRAP-PCR反应体系中5个主要因素（dNTPs、Mg2＋、TaqDNA聚合酶、引物和DNA）进行了优化以建立合适的SRAP反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中,各因素的最佳加入量分别是：dNTPs（2．5mmol／L）3．2μL、Mg2＋（25mmol／L）1．6μL、TaqDNA聚合酶（2．5u／μL）0．16μL、引物（10μmaol／L）0．6gL、DNA模板120ng。对该SRAP—PCR反应程序中的退火温度和循环次数筛选表明,最佳退火温度为57℃,循环次数为35次。该优化体系的建立,为进一步对烟草抗PVYN突变株SN01的抗病基因研究提供了可靠基础。     

蓖麻DNA的提取及SRAP反应体系的建立

为建立蓖麻快速有效的DNA提取方法和SRAP标记的技术体系,本研究采用SDS法和CTAB法对蓖麻不同叶片（新鲜嫩叶、老叶和陈旧的嫩叶、老叶）的基因组DNA进行提取,并以DNA模板用量、Mg^2＋浓度、引物浓度和Taq酶用量4个因素的不同水平配制了10个反应体系对蓖麻SRAP反应体系进行优化。结果表明,SDS法和CTAB法均可获得较高质量的DNA,多数样品的A260／A280值介于1．7～1．9之间,但以CTAB法更为省工省时,不同叶片DNA的提取效果,以嫩叶效果最佳;设计的10个反应体系中,以反应体系A（总体积为15μL,40ng DNA模板,1．5mmol／L Mg^2＋浓度,0．2mmoL／L dNTPs,0．3μmol／L引物浓度和1Unit Taq酶）最为经济适用,将该体系用于蓖麻的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。本实验为蓖麻的遗传多样性研究及目标性状的分析定位提供了技术支撑。     

多重PCR法检测鲜切哈密瓜中3种食源性致病菌

建立可同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。根据单增李斯特菌inl A基因、鼠伤寒沙门氏菌inv A基因、大肠杆菌O157:H7的wzy基因设计3对特异性引物。对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2+浓度、d NTP浓度进行了优化,并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件。结果表明:25μL反应体系,10×PCR buffer为2.5μL,Mg Cl2(25 mmol/L)为3.5μL,d NTPs(2.5 mmol/L)为2μL,inl A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,inv A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,wzy基因上下游引物(5μmol/L)为2μL,单增李斯特菌DNA模板为1μL,鼠伤寒沙门氏菌DNA模板为1μL,大肠杆菌O157:H7 DNA模板为1μL,ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)为0.3μL,加dd H2O补足25μL。反应条件为95℃预变性3 min;94℃变性30 s,53.9℃退火30 s,72℃延伸30 s,32个循环;72℃延伸10 min。鲜切哈密瓜中人工接种的目标菌的灵敏度为单增李斯特菌2.7×104 CFU/g,大肠杆菌O157:H7 3.3×104 CFU/g以及鼠伤寒沙门氏菌3.8×104 CFU/g。该技术可为快速检测鲜切哈密瓜中病原菌污染度及其控制提供参考依据。     

酿酒葡萄品种SSR-PCR体系的优化与建立

以酿酒葡萄品种为原料,研究了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系的主要成分对葡萄简单序列重复(simple sequence repeats,SSR)扩增结果的影响,并确定了各成分的最佳用量。以改良的十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)从葡萄中提取基因组DNA,通过单因素试验分析SSR-PCR体系中主要成分Mg2+浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和模板DNA浓度对葡萄SSR-PCR反应体系扩增效果的影响。同时,采用正交优化设计试验确立酿酒葡萄SSR-PCR最佳25μL反应体系为Mg2+浓度为2.5 mmol/L,d NTPs为0.15 mmol/L,Taq DNA聚合酶为1.5 U,引物为0.5μmol/L,DNA含量为40 ng/25μL。通过优化试验的直观分析和方差分析得出PCR体系的主要成分对扩增结果的影响程度依次为:Mg2+Taq DNA聚合酶d NTPs引物模板DNA。利用此体系对4个酿酒葡萄品种DNA进行SSR-PCR反应体系扩增并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果扩增条带清晰稳定,说明该体系可用于酿酒葡萄品种SSR标记的研究。     

附子ISSR-PCR反应体系的建立

ISSR分析可对附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata）的遗传多样性进行研究.为获得清晰、重复性高的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的多个因素,包括DNA模板浓度、Taq酶用量、引物和Mg2 浓度进行了比较、优化.研究表明,10-60n9模板DNA,1UTaq酶,0.2μmol/L引物,1.5mmol/L MgCl2,4种dNTPs各200μmol/L,10xPCR缓冲液构建的20μL的ISSR反应体系为最适体系.     

大豆SCoT分子标记技术体系的优化、验证及检测

采用L25（56）正交试验和单因素试验2种方法对影响大豆SCoT-PCR反应的Mg2＋浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA用量等因素进行优化,优化后的20μL大豆SCoT-PCR体系为：Mg2＋浓度2.0mmol·L-1、Taq聚合酶用量1.5U、引物浓度0.250μmol·L-1、dNTPs浓度0.2mmol·L-、DNA模板用量30ng;退火温度最适为50.4℃.运用18个大豆品种验证,该反应体系稳定、可靠,并从82条引物中筛选出条带清晰、多态性较好的32条引物.利用大豆品种吉育75、本地黑豆及其10株F2对该反应体系进行了初步的遗传验证,结果显示,杂交后代植株中出现了双亲的位点和亲本位点的缺失.该反应体系的建立为大豆种质遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种提供了新的技术手段.     

烤后烟叶多重PCR反应体系的优化

以烤烟品种中烟100为模板,利用两对SCAR引物,采用单因素和正交优化试验,研究烤后烟叶多重PCR反应体系中各主要因素的影响情况,建立了适合烤后烟叶多重PCR扩增的最佳反应体系:20μL体系中含模板DNA 45 ng,Mg2+浓度2.50 mmol/L,d NTP浓度0.40 mmol/L,Taq酶用量4.00 U.该体系多重扩增条带清晰,可缩短鉴别时间,为利用多重PCR技术鉴别烤烟DNA指纹图谱奠定了基础.     

烟草靶斑病菌基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

采用改良的CTAB法,对16个烟草靶斑病菌菌株进行基因组DNA的提取,所得的DNA样品的OD26o/OD280值在1.76～1.89之间,电泳主带清晰,无弥散、拖尾现象,DNA质量较高.通过单因素和正交设计结合的方法对影响RAPD-PCR反应的主要因子Mg2+,dNTP,引物的浓度和模板DNA,Taq酶的用量进行了优化,建立了适宜于病菌的RAPD分子标记的最佳反应体系.优化的反应体系为:模板DNA 10 ng,Mg2+浓度3.25 mmol/L,dNTP浓度0.175 mmol/L,Taq酶1.4 U,引物浓度0.5 μmol/L,反应体系总体积为25 μL.通过该反应体系可以获得清晰、稳定、特异性的分子标记谱带,扩增结果较好.     

发酵肉制品总微生物RAPD扩增条件的优化

以改进的氯化苄法抽提发酵肉制品总微生物DNA,进行随机扩增多态DNA(random amplifiedpolymorphicDNA,RAPD)分析.采用单因子梯度试验法对影响发酵肉制品微生物RAPD反应的反应体系、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量及DNA模板浓度进行了筛选.结果表明,发酵肉制品微生物RAPD扩增条件为25μLPCR反应体积中,2.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTPs,15pmol引物,50ng模板DNA,1.0U Taq DNA聚合酶.     

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法。根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法。优化的反应体系为：1.6 μmol/L内引物（FIP和BIP）,0.2 μmol/L外引物（F3和B3）,4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStart? DNA聚合酶,120 μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60 ℃,扩增时间60 min。在可视化LAMP体系中添加两条环引物（LF和LB）反应时间可缩短至20 min。该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.010 3 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46 株金黄色葡萄球菌和24 株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性。本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术。     

环介导恒温扩增快速检测植物油中掺假地沟油方法的建立

以植物油中不应存在动物源性成分为鉴定依据,建立食用植物油中掺假地沟油的环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,以动物线粒体DNA为检测靶标,根据脊椎动物线粒体基因组高度保守序列设计了两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP),采用LAMP实时荧光法和染色法对扩增产物进行比较分析,对甜菜碱和Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)量进行了优化,并进一步评价方法的特异性、灵敏度和稳定性。结果表明,在1.6 μmol/L内引物(FIP和BIP),0.2 μmol/L外引物(F3和B3),6 mmol/L MgSO₄,1.6 mmol/L dNTP,10×Thermo pol Buffer,8 U Bst DNA聚合酶,扩增温度为65℃,扩增时间为1 h的优化条件下,能够一次同时扩增出牛、羊、猪和鸡等脊椎动物DNA序列,检出植物油中最低含量为0.01 ng/μL的动物源性DNA,优化后的LAMP方法特异性好,仅能扩增出动物源性DNA序列、重复性好、稳定性高,可用于油脂中动物源性成分的检测,为油脂鉴伪和地沟油的鉴别提供一种稳定、高效、适应性强的现场快速检测技术。     

烟草DNA的提取与SRAP反应体系的建立

以10个烟草栽培品种为试验材料,研究了烟草DNA的提取方法以及对建立烟草SRAP-PCR反应体系的影响因子设置梯度实验,筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应条件:在25μL的反应体系中,MgCl22.0mmol、dNTP200μmol,上下引物各30ng、DNA模板40ng、DNA聚合酶1.5U,扩增程序为:在94℃预变性5min,反应前5个循环在94℃1min,33℃1min,72℃1min条件下运行;随后的30个循环复性温度提高到53℃,最后72℃延伸5min。本文还讨论了不同分子标记在烟草中应用的优缺点以及SRAP分子标记在烟草上的应用前景,提出了应用SRAP分子标记构建烟草遗传图谱的可行性。      

可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分

根据GenBank中公布的猪线粒体色素细胞b基因序列设计6 条特异性环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,通过简化线粒体DNA提取步骤,优化反应体系,以常见的牛、羊、鸡、鸭、马、驴肉为阴性对照验证该方法的特异性,掺假率梯度稀释以验证该LAMP法的最低检测限,建立常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法。结果表明：该方法提取目的基因操作简单、稳定,该可视化LAMP检测法以4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚钠盐为指示剂,能准确检测出常见肉类中猪肉是否掺杂,检测结果肉眼可见,灵敏度为10 pg/μL。     

鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法的建立及优化

目的 建立及优化鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法。方法 本研究比较了植物 DNA 快速提取试剂盒法、棉签法、纤维素膜片法和滤纸片法 4 种方法提取 15 种鲜榨果汁基因组 DNA 的效果，并筛选不同的提取液和裂解液、优化裂解液中的盐酸胍浓度和果汁基因组提取时间。结果 滤纸片法采用DNA裂解液（6 mol/L盐酸胍、1%聚乙烯吡咯烷酮、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20 mmol/L乙二胺四乙酸、21.3 mmol/L曲拉通-X-100；pH 6.4）、DNA漂洗液1（8 mol/L盐酸胍、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；pH 6.4）和DNA漂洗液2（10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100 mmol/L氯化钠；pH 8）即可在 5 min 内从鲜榨果汁中提取得到适用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的基因组 DNA。结论 本研究建立的滤纸片法不需要离心机等昂贵的仪器设备、操作简单、无刺激性气味、无环境条件限制，具有快速、价廉、环保等优点，为果汁基因组 DNA 快速提取与现场鉴定研究提供了参考。     

甜叶菊随机扩增多态性DNA技术优化及亲缘关系研究

以甜叶菊为试材,对影响其随机扩增多态性DNA标记反应体系的7个因子进行优化,同时对来自国内外的12个品种进行亲缘关系分析。结果表明,20μL的优化体系包括:双蒸水13.6μL,10×Buffer(含15mmol/LMgCl2)溶液3μL,2.5mmol/L的dNTPS1.2μL,10μmol/L的引物1μL,20ng的模板DNA1μL,1UTaq聚合酶;热循环程序为:94℃预变性4min,94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸1min,40个循环,最后72℃延伸7min。聚类图结果表明,品种间的遗传距离变异范围为0.12～0.88,在遗传距离为0.37时,8个引物可将12个品种分为四大类,来自日本的2个品种与国内品种关系较远。     

果汁DNA提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究

以橙汁为研究对象,选取市售100%橙汁及橙汁饮料各3种,采用CTAB法、SDS-CTAB法以及改良CTAB法提取其DNA,对所提取的DNA的浓度、纯度及扩增效率进行比较;同时选取橙UDP-葡糖基转移酶蛋白基因设计柑橘属植物特异性扩增引物,通过定性PCR检测其特异性和灵敏度,并应用于果汁中柑橘属植物的检测。实验结果证明,由改良CTAB法获得的DNA模板质量较高,适用于果汁中DNA的提取。UGT基因引物可对柑橘属植物产生特异性扩增,最低检测限为10pg/μL。将该引用物用于市售橙汁的检测,其检测结果为阳性,从而证明UGT基因特异性引物可用于果汁中的柑橘属植物成分的检测及鉴伪研究。