解析红曲黄酒酿造体系真菌多样性的PCR-DGGE引物筛选方法

在红曲黄酒酿造真菌菌群DGGE解析过程中,引物的选取十分关键。本文建立了一种适合于黄酒酿造体系中真菌菌群多样性解析的PCR-DGGE引物筛选方法。该方法从红曲黄酒酿造真菌菌群的序列特性出发筛选引物,筛选指标包括引物对的匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量等序列特性,通过综合比较各引物对之间指标的优劣来确定最适引物对。分别利用新构建的PCR-DGGE引物筛选方法和DGGE多样性分析对3对常用的真菌引物进行评估。结果表明,两种方法均显示NS1/GCFung引物扩增效果好,区分度最高,最适合于红曲黄酒酿造体系真菌菌群多样性解析。采用本方法选取的引物具有很强的针对性,可以省去繁琐的多引物筛选或联用的试验操作工作。本方法还可为其它酿造体系或微生物体系的微生态研究提供借鉴。     

传统浓香型白酒大曲发酵过程中细菌和真菌动态变化研究

研究采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对浓香型白酒大曲生产过程中细菌和真菌群落的多样性进行了研究。结果表明,16S r DNA的条带数、优势度、多样性和相似性在DGGE模式中明显不同,反映了不同阶段存在的细菌群落的广泛多样性。真核微生物群落的条带丰度和优势度在不同时期有所不同。     

PCR-DGGE技术在肉制品中微生物分析中的应用

<正>PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)是一种分析微生物区系的分子指纹技术。本文概述了PCR-DGGE的基本原理、发展和在食品微生物分析中应用现状,着重阐述该技术在评价肉制品中的细菌群落组成和动态变化、肉品微生物鉴定等研究领域中的应用以及该技术存在的一些缺点,并进一步展望DGGE技术在今后肉制品研究领域的应用前景。变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)     

基于PCR-DGGE技术对库尔勒香梨“黑头病”病变组织生物群落的初步研究

为了解库尔勒香梨"黑头病"病变组织中真菌群落结构特征,应用PCR-DGGE技术对库尔勒地区4个不同保鲜库中12个样品真菌群落结构进行了研究。根据DGGE图谱对生物多样性进行了分析。结果表明,所有样品群落结构存在一定的差异,造成差异的原因可能与库尔勒香梨的种植环境有关;不同样品的9号条带在整个病变过程中优势度最高,其代表的菌株,可被认为是导致库尔勒香梨"黑头病"的主要致病菌;对DGGE的优势条带序列分析,同源性最高的微生物属于链格孢属(Alternaria)。该研究初步揭示了库尔勒香梨病变组织中微生物群落的变化规律,为库尔勒香梨"黑头病"的研究提供理论依据。     

利用nested PCR-DGGE技术分析江苏啤酒大麦真菌群落结构

为了探索真菌群落对啤酒大麦麦芽的影响,首先要了解啤酒大麦真菌群落结构。文中采用9种不同方法提取了啤酒大麦总DNA,利用嵌套聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(nested PCR-DGGE)技术,分析了啤酒大麦真菌群落结构,明确了啤酒大麦中优势真菌种属信息。不同DNA提取方法,nested PCR-DGGE分析结果有显著差异。啤酒大麦中的主要真菌为Cochliobolus sativus、Alternaria alternata、Fusarium sporotrichioides、Coniothyrium fuckelii、Aspergillus sp.和Saccharomyces cerevisiae等子囊菌门真菌以及Sporobolomyces roseus、Cryptococcus magnus和Entorrhiza fineranae等担子菌门真菌。该研究丰富了对啤酒大麦真菌群落结构的认识,同时也证明nested PCR-DGGE技术是一种能够快速有效地研究啤酒大麦真菌群落结构的技术。     

豉香型白酒酒丸、酒饼及酒醪中微生物群落多样性研究

通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术解析豉香型白酒在生产过程中的酒丸、酒饼和发酵醪液的不同发酵期的微生物群落结构,获得表征豉香型白酒酒丸、酒饼和发酵醪液中细菌和真菌群落结构的DGGE指纹图谱。结果表明,三类样本（酒丸、酒饼和发酵醪液）细菌共有29种,其中乳酸菌属（Lactobacillus）和嗜盐单胞菌属（Halomonas）为优势菌群;真菌共有21种,其中酵母属（Saccharomyces）和毛霉属（Mucor）为优势菌属。在发酵醪液中还检测出了许多未培养微生物。酒丸和发酵醪液发酵开始时微生物数量较少,发酵后期微生物数量达到顶峰,酒饼则随着贮藏时间增加,微生物种类不断减少而趋于稳定。PCR-DGGE技术初步鉴定了部分代表性细菌和真菌的种属类群以及一些未培养微生物,比传统培养法更全面和精确。     

Nested PCR-DGGE Analysis of the Fungi Community of Jiangsu Local Malting Barley

为了探索真菌群落对啤酒大麦麦芽的影响，首先要了解啤酒大麦真菌群落结构。文中采用9种不同方法提取了啤酒大麦总DNA，利用嵌套聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳（nestedPCR-DGGE）技术，分析了啤酒大麦真菌群落结构，明确了啤酒大麦中优势真菌种属信息。不同DNA提取方法，nestedPCR—DGGE分析结果有显著差异。啤酒大麦中的主要真菌为Cochliobolus sativus、Alternaria alternata、Fusarium sporotrichioide5、Coniothy。riumfuckelii、Aspergillus sp．和Saccharomyces cerevisiae等子囊菌门真菌以及Sporobolomyces rosetts、Cryptococcus magnus和Entorrhiza fineranae等担子菌门真菌。该研究丰富了对啤酒大麦真菌群落结构的认识，同时也证明nestedPCR—DGGE技术是一种能够快速有效地研究啤酒大麦真菌群落结构的技术。     

青菜泡菜工业发酵过程中微生物群落结构变化分析

采用PCR-DGGE和qPCR技术检测四川工业青菜泡菜发酵过程中微生物群落组成。细菌DGGE条带表明,工业青菜泡菜中含有2个门,分别是厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria);共有12个细菌属,包括乳杆菌属(Lactobacillus)、盐单胞菌属(Halomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)等,其中乳杆菌属的相对丰度最高,qPCR检测其含量为10~7～10~(11) copies/mL。真菌DGGE条带表明,工业青菜泡菜的真菌属有5个,分别是德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、柯达酵母属(Kodamaea)、Cystofilobasidium,其中德巴利氏酵母属的相对丰度最高。     

应用PCR-DGGE技术构建不同酵素微生物指纹图谱的初步研究

本文利用PCR-DGGE技术分析对比了不同酵素的微生物群落结构,从原始样品中直接提取总DNA,并对其16S r DNA的V3区进行扩增。通过分析发现,6种不同酵素中大约有5种优势菌群,相互之间存在一定联系且相互之间差异性不大。通过分析DGGE图谱与系统发育树的结合,能为观察微生物菌落结构提供直观的图谱,由此可见,PCR-DGGE技术是研究发酵食品及其它天然微生态样品的先进方法。     

中温大曲在发酵和贮存过程中微生物群落结构分析

通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术解析中温大曲在不同发酵期和贮存期的微生物群落结构,获得表征中温大曲细菌和真菌群落结构的DGGE指纹图谱。结果表明,中温大曲细菌有19种,其中芽孢杆菌属（Bacillus）和乳酸菌属（Lactobacillus）均属于优势菌群;真菌共13种,其中根霉属（Rhizopus）和酵母属（Saccharomyces）均属于优势菌。大曲微生物总体的变化趋势是发酵开始时微生物数量较少,发酵中期（4～8 d）微生物数量达到顶峰,大量细菌和真菌旺盛繁殖,发酵后期（12 d）微生物群落逐渐减少并趋于稳定;贮存期内,微生物的种类的趋于平稳,数量变化较大。     

Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis to evaluate acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar

Acetic acid bacteria (AAB) are fastidious micro-organisms to isolate and cultivate despite of the great number of growth media available. Moreover, conventional techniques used to study AAB populations are time consuming and not completely reliable. In this study, we tested the usefulness of the polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electophoresis (PCR-DGGE) as a rapid and cost effective method for the screening of AAB in traditional balsamic vinegar (TBV). DGGE analysis was applied to 19 AAB strains isolated by agar plating from three different samples of TBV. DGGE was also used for the analysis of PCR products obtained from DNA extracted directly from the TBV samples. A tentative species identification was achieved comparing the PCR-DGGE patterns of the isolated strains and the TBV samples to those of 15 AAB reference strains. The results support that DGGE is functional to monitor vinegar's AAB population.     

应用PCR-DGGE技术分析不同性状窖泥的细菌群落结构

基于聚合酶链式反应-变性梯度凝胶（PCR-DGGE）技术分析了不同性状窖泥的细菌群落DGGE指纹图谱,结果表明,通过DGGE指纹图谱能够区分新窖泥、窖壁泥和窖底泥,其中以窖壁泥退化前后图谱变化最明显。PCR-DGGE图谱优势条带测序结果显示,窖泥中细菌微生物包括拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、变形菌门4类,其中新窖泥微生物种类最丰富,涵盖以上门类,特有优势微生物为Enterobacterale科、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）及里氏杆菌属（Riemerella）。紫单孢菌科（Porphyromonadaceae）仅存在于窖底泥中,Tumebacillus属微生物只存在于窑壁泥中。通过窖泥的DGGE图谱对比分析,能够对窖泥类型做出初步判定,并能及时发现窖泥退化现象,为工厂窖泥培养、检测和窖泥优化提供了理论支持。     

变性梯度凝胶电泳技术在食品微生物多样性研究中的应用前景

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)可以克服传统微生物检测方法的弊端,不依赖于微生物的分离培养,是微生物分子多样性研究的热点技术之一。DGGE技术具有可靠性强、重复性好、易操作、可同时分析多个样品等优点,结合聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),被广泛地应用在微生物群落组成及其遗传信息、多样性及不同种群动态比较分析等方面。本文介绍了DGGE技术的基本原理、操作过程、优缺点,并概述了其在食品微生物多样性分析中的应用,分析了该技术在水产品、酒类、发酵食品、肉制品等领域应用现状。通过分析目前在食品微生物多样性分析中的优点和不足,提出发展方向,最后对DGGE技术在食源性致病菌溯源应用前景进行评述,以期为我国食品安全食源性致病菌快速溯源技术的发展提供文献支持。     

Monitoring the lactic acid bacterial diversity during shochu fermentation by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis

The presence of lactic acid bacteria (LAB) during shochu fermentation was monitored by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and by bacteriological culturing. No LAB were detected from fermented mashes by PCR-DGGE using a universal bacterial PCR primer set. However, PCR-DGGE using a new primer specific for the 16S rDNA of Lactococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Enterococcus, and Vagococcus and two primers specific for the 16S rDNA of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella revealed that Enterococcus faecium, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides, and Weissella cibaria inhabited in shochu mashes. It was also found that the LAB community composition during shochu fermentation changed after the main ingredient and water were added during the fermentation process. Therefore, we confirmed that PCR-DGGE using all three primers specific for groups of LAB together was well suited to the study of the LAB diversity in shochu mashes. The results of DGGE profiles were similar to the results of bacteriological culturing. In conclusion, LAB are present during shochu fermentation but not dominant.     

用DGGE技术构建白酒酿造微生物指纹图谱的初步研究

利用PCR-DGGE技术及Quantity One软件分析对比了大曲、酒醅不同部位的微生物群落结构.通过从原始样品中直接提取DNA,并对全长16s rDNA及其V3区片断扩增,变性梯度凝胶电泳及软件分析等,发现不同样品之间的微生物群落存在一定联系及差异性.通过图谱与系统发育树的结合,能给不同样品赋予特定的分子标签.显示DGGE技术能为微生物菌落结构提供直观图谱,是研究自然传统发酵食品及其它天然微生态样品的先进方法.     

Genus-specific profile of acetic acid bacteria by 16S rDNA PCR-DGGE

An effective method for grouping acetic acid bacteria (AAB) genera was defined and evaluated as a tool for preliminary screening of the major AAB species involved in vinegar production. Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter, Asaia, Neoasaia, Saccharibacter, Frateuria and Kozakia AAB strains were screened on the basis of the 16S rDNA sequences using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technique. The DGGE profile of all the strains tested, consisted of one single band of approximately 330 bp for each strain and allowed their clustering. The results obtained clearly reflected in silico phylogenetic analysis of the AAB species used in this study, in fact, the species with a higher 16S rDNA sequence homology showed a similar electrophoretic profile. In particular almost all the species belonging to the genus Gluconacetobacter showed a DGGE pattern nearly identical and well distinct from all the other AAB genera. Furthermore by PCR-DGGE it was possible to clearly group the species more frequently recovered from vinegar fermentation which are mainly distributed in the genera Acetobacter, Gluconobacter and Gluconacetobacter.     

冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响

比较研究冷却猪肉不同前处理对细菌DNA 提取及PCR- 变性梯度凝胶电泳(DGGE)的影响。冷却猪肉4℃贮藏至第5 天时,分别采用冻融、超声、摇床和匀浆前处理后,提取细菌DNA,进行Dilution-PCR 和DGGE 分析。结果表明,不同前处理方法所制备的DNA 量稍有差别,但对PCR-DGGE 结果无显著影响,故可根据实际情况选择上述不同前处理方法。同时对16S rDNA V3 区的DGGE 图谱进行割胶测序,检测到腐败菌主要是假单胞菌属,其他还有不动杆菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属。     

酿造废水处理系统中微生物多样性的分析

利用PcR_DGGE技术,对酿造废水处理系统的微生物多样性进行分析研究。分别对厌氧罐中活性污泥以及加入酿造废水后不同时间段的活性污泥进行微生物总DNA提取,特异扩增16SrDNA基因的V4-6可变区,并结合DGGE技术,对优势条带进行克隆测序及序列分析。结果表明：酿造废水厌氧处理系统中的微生物种类较为丰富,但有明显的优势种群,在不同时间段微生物多样性丰度也有明显变化。DGGE图谱中17优势条带测序比对后,初步确定了12种菌属。     

The rpoB gene as a target for PCR-DGGE analysis to follow lactic acid bacterial population dynamics during food fermentations

Culture-independent molecular techniques offer a valuable tool in the study and understanding of population dynamics in food fermentations. PCR-DGGE protocols have been developed based on the 16S rDNA gene; however, its heterogeneity complicates interpretation of the results. The rpoB gene, encoding the RNA polymerase beta subunit, usually exists in a single copy and offers a valuable alternative for PCR-DGGE analysis. In this study, PCR products generated from the rpoB gene of several strains of lactic acid bacteria (LAB), responsible for various fermentations, were analysed by DGGE, and a database of rpoB partial sequences was created. Unique DGGE profiles were obtained for rpoB sequences from the Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc and Weisella strains tested, allowing their identification and differentiation in complex ecosystems, such as fermented food products. The application of rpoB targeted PCR-DGGE to tracking ecological changes in food systems during maturation was validated in fermented sausage and cheese.     

PCR-DGGE技术在食品微生物中应用的研究进展

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)结合变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技术能快速的研究微生物物种多样性,该技术不依赖于微生物的分离培养,便能快速、准确地获取复杂样品中微生物的菌群组成及其遗传信息,因此被广泛应用于微生物生态学、食品微生物学等领域。本文主要介绍了PCR-DGGE在食品微生物中和其他一些方面应用的研究进展。